ペプチド単離の実践的アプローチ

カラムの選択

理想的には、通常の状態のペプチド（酸性残基、塩基性残基、非極性残基の混合状態）、塩基性ペプチド、高分子ペプチド（30～40 残基）および疎水性ペプチドを含むすべてのサンプルで 1 つのカラムケミストリーを使用することで、手持ちのカラムが減り、各粗サンプルに関して複数のカラムをスクリーニングする必要性がなくなります。C₁₈ は数多くのペプチド分離で一般的に使用されていますが、C₁₈ が結合しているベースパーティクルもクロマトグラフィーの保持、分解能およびピーク形状に影響を与える重要な因子です。XBridge Peptide BEH カラムは、シリカ単体ではなくエチレン架橋型ハイブリッドパーティクルがベースになっています。BEH（架橋型エチルシロキサン/シリカハイブリッド）パーティクル（図 7）は、ペプチドとの二次相互作用が最小限に抑えられており、分離条件の開発において最大限の柔軟性を達成できるように高 pH と低 pH の両方で安定です。合成充塡剤は、粒子径 3.5、5、10 µm でポアサイズ 130 Å または 300 Å をご利用いただけます。特殊なサンプルや極端な疎水性のペプチドの場合、同じベースパーティクルを C₈ または C₄ でご利用いただけます。

さまざまなカラムサイズにおけるペプチド質量負荷量の近似値を表 1 に記載します。

表 1.逆相でのペプチド質量負荷量の近似値

*5 µm および 10 µm の OBD 分取カラム、** 10 µm OBD 分取カラム。

多くの因子が分取カラムの質量容量を左右します。リストに記載されている容量は、各サイズに適切な流量と注入量における「平均」推定値を示しています。以下の要因は検討する価値があります。
1）ペプチドの容量は、主に特定のサンプルの可溶性により異なります。
2）より高い分離能が求められる場合、容量は小さくなります。
3）容量は負荷条件に左右されますが、低分子ほど影響が大きくなります。
a）ペプチドは通常、含水量の多い条件で、多くの場合 TFA が添加されてロードされます。このような条件下での負荷量は実質的に制限がありません。容量は溶出中の溶解度により制限されます。
b）乾燥ペプチドは DMF や DMSO などの溶媒で湿潤します。多くの場合、その後、上記のように TFA を含む水で希釈されます。
c）ペプチドを DMF や DMSO に溶解し、その溶液中で注入することもあります。図中の容量ガイドラインはこの条件に当てはまります。
4）適切な注入量は、比較的強い溶媒を用いた長さ 50 mm のカラム直径に基づきます。カラムを長くすればより大きな注入量に対応できますが、この関係は正比例ではありません。溶媒が弱いと注入量が大幅に増加します。
5）適切な流速はカラム径に基づきます。カラムが長くなり、粒子径が小さくなると背圧が上昇してシステムが制限されます。低分子より長い時間をかけてペプチドを分析することを好むユーザーは、推奨流量の半分を使用し、グラジエント時間を 2 倍にします。

標準的なペプチド単離のカラム選択肢としての XBridge Peptide BEH C₁₈ 130 Å の適合性は、性質が異なる 4 種類のペプチドの検査後に得られる結果に基づいて定義されました。ペプチド配列は公開されていませんが、各ペプチドの特記すべき性質を表 2 に記載します。

表 2.ペプチドテストパネルの特性

ペプチドは、弱酸性（カルボン酸）の官能基と弱塩基性（アミノ酸）の官能基の両方を持つため両性状態です。ペプチドは正電荷と負電荷の両方を持つため双性イオンとも呼ばれます。ペプチドが特定の水素イオン濃度の溶液に溶解された状態で、電場の影響を受けなくなって移動しなくなる場合、その水素イオン濃度はそのペプチドの等電点（pI）になります。簡単に言えば、等電点（pI）は、ペプチドの正味荷電がゼロになる pH です。

Browne、Bennet、Solomon が報告したように、HPLC インデックスは TFA：水：アセトニトリルのバッファー系を用いて C₁₈ µBondapak カラムからペプチドを溶出させるのに必要なアセトニトリルの割合を予測します。彼らは生体マトリックスからペプチドを単離し、アミノ酸組成に基づいて溶出プロファイルを予測しました。したがって、HPLC インデックス値が高いと C₁₈ カラム上での疎水性が高いことが示唆されます。もちろんカラムや移動相が異なる場合にはこの値は変化しますが、この単純な体系からはペプチドの性質に関するある程度の予測的情報が得られます。

非常に一般的な条件下（0.1% ギ酸水溶液および 0.1% ギ酸アセトニトリル溶液を用いた 50 分間で 5～50% B のグラジエント）における試験に含まれる 4 種類のペプチドのクロマトグラフィープロファイルを図 8 に示します。4 種類すべてのモデルペプチドに関して、シャープかつ対称的なピークを持つ全く問題のないクロマトグラフィーが確認されました。

高分子ペプチドや疎水性ペプチドに関しては 300 Å ポアサイズカラムを用いることでクロマトグラフィーが改善するかどうかを検討することが重要です。ペプチドテストパネルに含まれる最大のペプチド（39 残基、分子量 4000 Da 超） では、より大きなポアサイズの充塡剤を使ってもピーク形状にほとんど改善が見られません（図 9）。ペプチドの溶出はわずかに早くなり、その差は約 1～2% のアセトニトリルに相当します。130 Å ポアサイズの充塡剤の使用に関しては若干のサイズ制限があります。最も可能性が高いのは約 40 残基以上です。

HPLC インデックスが 113 の疎水性ペプチドも 130 Å と 300 Å の両方の充塡剤においてシャープかつ対称的なピークとして溶出します（図 10）。ペプチド構造（ペプチドが溶液中でどのように折り畳まれているか）も特定の分離に最適なポアサイズの選択に影響を与えます。ペプチド負荷量に明確なルールがないのと同様、個々のペプチドの性質も使用するのに最適なポアサイズの決定に関与します。上記の実験から、C₁₈ およびポアサイズ 130 Å の XBridge Peptide BEH カラムはペプチド単離の出発点として適切な選択肢となることが示唆されます。

より大きなスケールでペプチド単離を実施する上での経済的側面と効率の観点から、粒子径を検討することが重要です。異なる粒子径の 3 つのカラムで分析した塩基性ペプチドでは分離の一貫性が示されています（図 11）。スケーラブルな BEH カラム充塡剤の場合、大きな粒子径ではピーク幅が広く、十分な分離が得られませんが、粒子径が 3.5、5、または 10 µm であっても、化学的選択性に変わりはありません。大規模な分離では、粒子径の増加により、管理可能な圧力範囲で内径を広げたカラムで流速をより速くすることができる恩恵を受けられます。これらにより負荷量が増加し、クロマトグラフィー分析の実行回数が削減し、時間とリソースを節約できます。

ペプチドには粗混合物からの単離の成功に影響を与える特有の性質がありますが、分取クロマトグラフィーの基本原理を適用できます。ほとんどの場合で逆相カラムにおいて一般的なグラジエント（例えば 5 ～ 50% B または 5 ～ 95% B）を用いる標準的なペプチド単離プロトコルを使用できますが、特有の性質を持つペプチドでは純度、負荷量、または収率の要件を満たすために分離法開発が必要になることがあります。分離法は多くの場合、移動相溶媒、モディファイヤー、グラジエントの傾き、温度、pHまたはサンプル導入法を変更することで改善できます。これらの要因はそれぞれ分離、クロマトグラフィーの質、および最終的な単離の成功に影響を与えます。

溶媒の役割

移動相は、弱溶媒、強溶媒およびモディファイヤーという 3 つの成分で構成されています。逆相クロマトグラフィーでは、弱溶媒はほぼすべての場合で水です。メタノール、エタノール、イソプロパノールが強溶媒の役割を果たすと考えられますが、通常アセトニトリルが最適の溶媒です。その理由は、低粘度、わずかに高い溶媒強度、および低波長 UV 検出範囲（185～205 nm）での可用性です。アセトニトリルでは通常最高のピーク形状が得られ、蒸発しやすく、単離中や試験中に進行する可能性がある副反応の数が低減されます。良好な UV 透過率により、良好なピーク検出のための高い S/N 比が得られます。しかしながら、生物学的試験でペプチドを使用したいユーザーはアセトニトリルの使用に反対するかもしれません。

エタノールなどのアルコールで置き換えることで、アセトニトリルに伴う可能性のある残留毒性が低下します。生体適合性に関する懸念の他に、プロパノールまたはアセトニトリル：プロパノール混合物は多くの場合、高分子ペプチドや疎水性ペプチドの溶解度を高め、溶液中で形成されることのある凝集体を分散させます。塩基性ペプチドの溶出に対する 70% イソプロパノール、30% アセトニトリルの影響が、図 12 に示されています。メインピークの分離は最も近くで溶出される夾雑物に関して改善され、保持時間はほぼ半分に短縮されています。アルコールを含む移動相に関しては、粘性が高いためカラムの加温が必要になることが一般的です。

移動相モディファイヤーの役割

ペプチドは正電荷（アミノ末端）および負電荷（カルボキシル末端）の両方を持ち、これらが充塡剤の疎水性表面への親和性を低下させるため、逆相クロマトグラフィーを用いるペプチド単離では移動相に極性モディファイヤーを添加することが必要になります。図 13 に示すように、側鎖保護基も電荷を持つことがあります。モディファイヤーは弱酸性側鎖や弱塩基性側鎖のイオン化度を変えるために、pH を調節します。モディファイヤーはペプチドとイオン対を形成することもあります。特定のサンプルの分離は、これらのメカニズムを操作することで最適化できる可能性があります。

ギ酸は移動相の pH を低下させることによりペプチドの酸性側鎖をプロトン化し、負電荷の一部を除去します（図 14）。電荷を持つアミノ酸側鎖の数の減少により、カラムの疎水性表面への相互作用を増大させ、それが分離の向上を促進します。カラム表面に存在するほとんどのシラノールもプロトン化されている可能性がありますが、遊離シラノールは引き続きペプチドと結合できる状態になっています。このようなペプチドとシラノールの相互作用は、クロマトグラムにおけるピークテーリングとして現れます。

最もよく使用されているモディファイヤーであるトリフルオロ酢酸（TFA）では、カラムおよびサンプルとの相互作用のメカニズムが異なります（図 15）。pH が低いと酸性ペプチド側鎖がプロトン化され、イオン対形成により塩基性側鎖が中和されて、ピークテーリングの原因となる遊離シラノールへの結合を阻害します。電荷の低減とイオン対形成が組み合わさることで保持が高まり、溶出に高濃度の有機溶媒が必要になります。

架橋型エチルハイブリッドパーティクルのカラムを使用することのメリットは、シラノール相互作用を排除できることです（図 16）。ベース充塡剤はペプチドとほとんど相互作用しないため、ピークテーリングの低減のための TFA は不要になります。代わりに良好なピーク形状を維持しながら分離の選択性を変化させるために、ギ酸（FA）または TFA を使うことができます。図 17 に示すように、保持の差および溶出順序の変化は精製条件を調整するために使用できます。星印は 2 回の分離における同じ夾雑物ペプチドを示しており、選択性における多大かつ有用な変化を確認できます。

高 pH の役割

ペプチドと架橋型エチルハイブリッドカラム表面との相互作用を変化させるには、pH を上昇させることもできます。重炭酸アンモニウムなどのバッファーを使用することで、高 pH により酸性ペプチド側鎖が脱プロトン化され、イオン化されます（図 18）。重炭酸アンモニウムは塩基性ペプチド側鎖の脱プロトン化と中和も行い、それによりペプチドの電荷が低減し、カラムの疎水性表面へのペプチドの相互作用が増大します。塩基性ペプチド側鎖は少数の残留シラノールには結合せず、ピークテーリングが減少します。これらのメリットに加えて、重炭酸アンモニウムは揮発性があり、精製後のペプチド産物からの除去が比較的簡単です。0.1% の水酸化アンモニウムも移動相の pH を上げるために使用することができ、回収フラクションから容易に蒸発します。

極端な pH は分離の選択性を変化させます（図 19 および 20）。酸性ペプチド（図 19）は低 pH では逆相充塡剤での保持が高まりますが、これはすべての負電荷が中和され、カラムの疎水性表面と強力に相互作用するためです。逆に高 pH では、カラム充塡剤への強力な付着を阻害する負電荷が多いため、ペプチドの保持時間が短縮されます。この例では、ピーク形状は影響を受けていませんが、溶出順序の変化を分析法開発や、直交性のある戦略を用いたペプチドの特性解析に使用することができます。

塩基性ペプチド（図 20）では、予測どおり極端な pH において逆の挙動が認められています。高 pH では、ペプチドの塩基性残基が脱プロトン化され、非イオン化されます。ペプチドがカラムと強力に相互作用するため、ペプチドをカラムから溶出するのに有機溶媒移動相の割合を高めることが必要になります。pH 10 では分離能の改善を伴って選択性が変化することから、より高い純度のペプチドを単離する最終目標のためには高 pH がより魅力的になります。

注意：pH が低い移動相も高い移動相もハイブリッドパーティクルテクノロジーカラムに対応していますが、極端な pH における分析法条件はシリカベースのカラム充塡剤で使用してはいけません。過度な低 pH は結合相を切断します。高 pH はシリカパーティクルカラム基材を破壊します。特定のシリカベースカラムについて製造業者の推奨する pH 範囲限界を必ず確認してください。

温度の役割

温度管理は、確実で再現性のある分離を実施するためにクロマトグラフィーで最もよく使用されています。単離および精製では、その他の複数の理由から温度管理が重要になります。溶解度の限られた疎水性ペプチドは精製が最も難しいサンプルの 1 例です。分離温度を上昇させることで疎水性ペプチドの溶解度が高まり、一般的にはペプチドのクロマトグラフィーピーク形状が改善します。これが最終的に純度および分離の回収率を高め、単離がより迅速で効率的になります。

温度の変化によりクロマトグラフィー選択性が変化するため、カラムの加熱は特定サンプルの分離を最適化するための非常に便利なツールです。さらに、温度が上昇すると移動相の粘性および合計システム圧が低下します。システム圧が低下すると、システム、フィッティングおよびカラムへの負担が軽減し、最終的には操作の堅牢性が向上します。

温度管理は分析クロマトグラフィーでは日常的に実施されていますが、2 つの理由から温度は分取スケールのクロマトグラフィーを調整するためのパラメーターとしてはほとんど使用されていません。まず、直径の大きなカラムは外部から均一に加熱できません。次に、高流速分離は実際には流入する溶媒の温度で実施されます。電気毛布やカラムオーブンは小規模の分離には十分ですが、大きなカラムを均一に加熱することはできません。カラム直径および長さにわたり温度グラジエントが生じ、クロマトグラフィーに悪影響を与えます。

効果的なカラムの加熱は、溶媒プレヒーターループをカラムヘッドに挿入して、ループとカラムを目的の温度に保ったウォーターバスに完全に沈めることで達成されます（図 21）。プレヒーターループを連続的に流れる溶媒はカラムを内部から平衡化し、ウォーターバスはカラム外部の環境を安定化させます。溶媒プレヒーターループは内径の狭いチューブで構成されているため、ループが原因のバンド広がりの量は無視できます。流入するサンプルもカラムヘッドへ吸着することで再度集まります。

ペプチド分離に温度管理を用いる影響を、テストパネルペプチドの塩基性ペプチド（図 22）および酸性ペプチド（図 23）の 2 つについて示します。これらの例（赤色で強調）では、塩基性ペプチドのサンプル成分は 60 ˚C の方で良好に分離されていますが、酸性ペプチド粗混合物成分は 40 ˚C の方が良好に分離されています。しかしながら、酸性または塩基性のペプチドに最適な温度を予測することはほぼ不可能であり、個々の配列に特有の性質に左右されるため、これらの所見は全く偶然です。

溶媒、移動相モディファイヤー、pH および温度の大幅な変更はペプチド分離に影響を及ぼすため、クロマトグラフィーを最適化するための分析法開発ツールとしてこれらのパラメーターのいずれか 1 つを単独または他のパラメーターと併せて使用することができます。XBridge Peptide BEH カラムテクノロジーなどの安定なハイブリッドパーティクルが充塡されたカラムを 1 つ選択することで、ペプチド単離に必要なカラム数を減らし、スクリーニング時間を短縮して精製プロセスを単純化できます。図 24 の塩基性ペプチドのクロマトグラフィーは、小さな変化が分離に及ぼす影響を示しています。特有の性質を持つこれらのペプチドの場合、分離を最適化するには他のカラムケミストリーが役に立つ可能性があります。

グラジエントのフォーカス

単離および精製のためのクロマトグラフィー分離は、分析分離と同じ物理的原理および化学的原理により決定されます。しかしながら分取実験では、化合物は高い質量負荷量で、多くの場合大きなカラム上で単離されるため、回収産物の純度および回収率を高めるためには高い分離能が必要です。緩いグラジエントの形成は分離を向上するための最初のアプローチとしては適していますが、分離全体でグラジエントの傾きを変更するとピークが広がり、合計実行時間が長くなります。セグメントグラジエントおよびフォーカスグラジエントでは、合計実行時間を延長せずに、高い分解能が必要な分離の一部のみでグラジエントの傾きを減らします（図 25 および 26）。

リニアグラジエントは、規定の期間にわたり低い有機濃度から高い有機濃度へと進行し（つまり、5 ～ 50% B または 5 ～ 95% B）、多くの場合、サンプルスクリーニングで使用されます。サンプル成分間の分離が良好で、実行時間が適度に短い場合には、分取クロマトグラフィーでも採用されることがあります。セグメントグラジエントでは、分析法の傾きがゆるくフォーカスされた部分の前後で同じ傾きを維持して、これらの分離部分におけるクロマトグラフィープロファイルを保持します。クロマトグラムのゆるくフォーカスされた部分ではグラジエントの傾きが少ないため、近くで溶出される不純物を目的のピークから効果的に離します。

フォーカスグラジエントは 1 つの産物だけをターゲットとすることを目的としています。溶媒強度は、サンプル注入に使用される低濃度から産物ピークの予測溶出点の約 5% 下まで急激に上昇します。一般的に、クロマトグラムの緩い部分は元の分離の傾きの約 5 分の 1 で産物ピークの溶出が予測される濃度の約 3% 上まで進みます。グラジエントの緩い部分が完了したら、有機移動相の割合を急激に上昇させてカラムから残留夾雑物を洗浄します。ペプチド混合物の複雑性のため、多くの場合、最適な分解能はカラム容量あたり 0.25% ～ 0.33% の変化の付近であり、これは低分子や複雑でないペプチドサンプルの場合に使用される元のスクリーニンググラジエント傾きの 5 分の 1 という一般的な傾きよりもわずかに緩くなっています。

システム容量はフォーカスグラジエントの設計で使用され、分析スケールから分取スケールへの基本的なスケーリングでも使用されます。システム容量はディレイボリュームやデュエルボリュームとも呼ばれ、グラジエントが形成される点からカラムヘッドまでの容量と定義され、HPLC 流路のすべてのコンポーネント、ポンプヘッド、パルスダンパー、ミキサー、注入ループ、チューブが含まれます。分析スケールと分取スケールで傾きが保たれる幾何学的スケーリングでは、システム容量によりグラジエント開始前にアイソクラティックホールドが必要になります。このホールドは、小スケールではカラム容量の数倍、大スケールではカラム容量の数分の 1 になります。最初の条件においてプログラムされたアイソクラティックホールドは分析スケールと分取スケールの間のシステム容量の差を補正するために使用されるため、実際のグラジエントが全く同じ時間に開始するようにできます。

移動相 A 溶媒は無添加で移動相 B 溶媒には適切な UV 吸収剤（つまり、2 mL/L のアセトン）が添加されているステップグラジエント（表 3）を用いることで、図 27 および図 28 の手順および計算によりシステム容量を容易に算出することができます。

表 3.分析および分取システムの容量決定のためのステップグラジエント

システム容量、カラム容量およびペプチドを溶出させる強溶媒の割合を推定し、これらの推定値からセグメントグラジエントまたはフォーカスグラジエントを作成して時間を節約することは可能ですが、実験的にシステム容量を決定し、得られた値を後の実験のために記録しておく価値はあります。システム容量は HPLC の接続に変更が加えられない限り変化せず、分析法の流量はシステム容量を測定するのに使用される流量と同じです。システム容量が実験的に決定されると、システムへの変更（注入ループのサイズ変更など）は容易に算出でき、さらに容量を測定する必要はありません。システム容量が決定したら、フォーカスグラジエント計算で利用できます。

フォーカスグラジエントの設計

フォーカスグラジエントは通常、粗サンプル混合物の分析に基づいて設計されますが、その手順は最初の分取分析ですでに使用したグラジエントの修正と同じです。以下の式を使うことで、フォーカスグラジエントの作成は容易になります。次のグラジエントにより、フォーカスグラジエントが設計されたと仮定します：4.6 × 100 mm カラム、システム容量 1.0 mL、カラム容量 1.097 mL*
ピーク保持時間 = 7.76 分

*カラム容量はウェブでご利用いただけるカリキュレーターまたはシリンダーの容量を用いて決定できます：V = πr²h。カラム充塡剤を考慮するために液量を減らすカリキュレーターもあるため、選択する分析法に応じて値はわずかに異なります。すべての計算で同じ分析法が使用されている限り、クロマトグラフィーは影響を受けません。

図 29 はこのグラジエントで分析された粗合成ペプチドのクロマトグラムです。
グラジエント組成のポイントと検出器の間のオフセットを計算します

オフセット = システム容量 + カラム容量

例：
オフセット = 1.0 mL + 1.097 mL
オフセット = 2.097 mL
溶媒が検出器に到着する時間を計算します
検出器までの時間 = オフセット（mL）
流速（mL/分）

例：
検出器までの時間 = 2.097 mL / 1.46 mL/分
検出器までの時間 = 1.43 分

ピーク溶出濃度が形成された時間を計算します

溶出濃度の時間 =
ピーク保持時間 – 検出器までの時間 – グラジエントホールド

例：
溶出濃度の時間 = 7.76 分 – 1.43 分 – 0.00 分
溶出濃度の時間 = 6.33 分

ピーク溶出（%）を計算します

溶出濃度（%）=
溶出濃度の時間/長さ（パイロット） × 変化（パイロット）/
グラジエントセグメント + 最初のパイロットグラジエント（%）/グラジエントセグメント

例：
溶出濃度（%）= 6.33 分/ 10 分 × 45% + 5%
溶出濃度（%）= 33.48%

注：割合に関するすべての計算では、絶対値のみを使用します（つまり、 0.45 × 6.33 ではなく 45 × 6.33 分）。

パイロットグラジエントの傾きをカラム容量あたりの変化（%）で計算します。

# カラム容量（CV）=
1 CV × 流速（mL） × グラジエントセグメント時間 × mL 分

例：
# カラム容量 = 1 CV × 1.46 mL × 10 分 / 1.097 mL 分
# カラム容量 = 13.3 CV

例：
パイロットグラジエントの傾き = パイロットグラジエントの変化（%）
パイロットグラジエントの傾き = 45% / 13.3 CV = 3.38% / CV

フォーカスグラジエントの傾きをカラム容量あたりの変化（%）で計算します。パイロットグラジエントの傾きの 5 分の 1 を使います。

フォーカスグラジエントの傾き（%/CV）= 1/5 × パイロットグラジエントの傾き

例：
フォーカスグラジエントの傾き = 1 × 3.38% / 5 CV
フォーカスグラジエントの傾き = 0.67% / CV

フォーカスグラジエントのセグメントを推定溶出割合の 5% 以下から 3～5% 以上までで作成します。ピークはアセトニトリル 33.5% で溶出します。緩いグラジエントではアセトニトリルを 28% から 36% にする必要があります。フォーカスグラジエントセグメントの時間を計算します。

フォーカスグラジエントセグメントの時間 =
変化率（%） × フォーカスグラジエントの傾き × カラム容量 × 流速（mL）

例：
フォーカスグラジエントセグメントの時間 =
8% × 1 CV / 0.67% × 1.097 mL / 1 CV × 1 分 / 1.46 mL
フォーカスグラジエントセグメントの時間 = 9.0 分

パイロット分析の最初の条件で開始し、ピークの溶出濃度（%）の 5% 以下まで直ちに上昇するフォーカスグラジエントを作成します。

図 30 の上のクロマトグラムはフォーカスグラジエントを用いて分析した粗ペプチドを示しています。近くで溶出される不純物は良好に分離されていますが、最初の傾きの約 10 分の 1 まで傾きを減らすと（下のクロマトグラム）不純物の最高の分離が得られました。この例では、傾きをカラム容量あたり 0.25 ～ 0.33% の変化まで減らすことで、複雑なペプチド混合物の分離にどのような影響を与えることができるかが明確に示されています。メインペプチドピークの保持時間は約 7 分、つまり元のスクリーニンググラジエントとほぼ同じ時間に保たれていることに留意してください。したがって、グラジエントのフォーカスにより実行時間を延長することなく分離能が向上しました。グラジエント全体の合計実行時間は長くなりますが、分析の早期終了などのその他の方法を使用して大スケールにおける単離プロセスを加速することができます。このペプチドは最終的には、緩いフォーカスグラジエントの幾何学的スケーリングにより単離されました。

サンプル導入

ペプチドの組成と配列は溶解度に直接影響を与えるため、合成ペプチドを溶解させるユニバーサルな溶媒や方法はありません。有用な溶媒の選択肢としては、0.1 ～ 2% のトリフルオロ酢酸、ギ酸または酢酸を添加した水、ジメチルスルホキシド、ヘキサフルオロイソプロパノール、6 ～ 12 M グアニジン HCl、ジメチルホルムアミド、0.1% 水酸化アンモニウム、10 mM 重炭酸アンモニウムなどがあります。製造者から、さまざまな種類のペプチドの溶解の実践的ガイダンスが提供される場合があります。ペプチドを溶解させると、多くの場合、強溶媒に比較的多量のサンプルが含まれます。

従来の分取クロマトグラフィーシステム（図 31）では、強溶媒で希釈したサンプルを大量に注入することでクロマトグラムにひずみが発生することが多く、単離できる産物の量が減少します。負荷量が増えると、近くで溶出される不純物の分離能が失われます。サンプルのループ側またはカラムヘッド側における水系移動相の存在が原因のサンプルの析出は、システムの堅牢性を低下させ、カラム寿命を短縮させます。

従来の分離では、DMSO または一部その他の強溶媒中でカラムに導入されたサンプルは直ちにカラムを通過し始め、サンプル分子もそれと共に運ばれていきます（図 32）。強溶媒がカラム内で希釈されるまで、サンプルは保持されません。残念なことに、サンプルバンドがカラムに保持されるまでに、カラムバンドはすでに広がっており、カラムベッド上でお互いに入り込んでいます。サンプル成分がカラムから溶出すると、バンドは明確でなくなり、各成分の純度は低くなります。

別の注入法、At-Column Dilution（ACD）では、大量の強溶媒の注入が可能であり、サンプル溶解度、カラム負荷量および分離能が同時に改善されます。ACD を用いる場合、クロマトグラフィーシステムは強溶媒中のサンプルがカラムヘッドで水系移動相により希釈されるように接続されます（図 33）。サンプルは非常に迅速に混合され、カラムに吸着されます。移動速度が非常に速いため、析出は発生しません。強溶媒は、サンプルの溶出が開始する前に、直ちにカラムから流され始めます。

グラジエントが開始されると、サンプル成分は幅の狭い少量のシャープに分離されたバンドとして溶出します（図 34）。

サンプル成分のピーク間の分離が改善することで、サンプル量を増やすことができ、それにより単離に必要な注入回数を少なくすることができます。実際、At-Column Dilution では多くの場合、カラム負荷量を 3 倍から 5 倍に増やすことが可能です（図 42）。サンプルはループやカラムヘッドではほとんど析出しないため、At-Column Dilution によりシステムの堅牢性が向上します。高圧によるシステム停止の発生率が低下し、カラム寿命が延びます。

実践的なペプチド単離例

分取クロマトグラフィーの原理は、ペプチドを含む、あらゆる種類の分子に適用されます。以下の例では、研究環境におけるペプチド単離のための一般的なワークフローが説明されており、上記の分析法最適化のための要因が適用されています。ラボのプロセス要件に応じて手順を調整できます。

この例で使用されたペプチドは、3 つの塩基性残基、2 つの酸性残基、8 つの非極性残基、4 つの極性残基が含まれている 17 個のアミノ酸で構成されていました。サンプルはボルテックスと超音波を用いてジメチルスルホキシドに溶解し、0.45 µm GHP Acrodisc シリンジフィルターでろ過しました。ペプチドのモノアイソトピック質量は 1772.9 Da で、チャージ状態は以下の通りでした。
[M+H]⁺ = 1773.9
[M+2H]²⁺ = 887.5
[M+3H]³⁺ = 592.2
[M+4H]⁴⁺ = 447.2

粗ペプチドのプロファイル

粗ペプチドサンプルでは、移動相に 2 種類のモディファイヤー（0.1% ギ酸および 0.1% トリフルオロ酢酸）を添加して分析し、どのモディファイヤーで良好な分離が実現するかを決定しました。移動相の有機成分としてはアセトニトリルが最もよく使用されますが、この例では説明のためにイソプロパノールを使用しました。結果を図 35 に示します。この図では、ギ酸（C および D）と比べると TFA モディファイヤー（A および B）において夾雑物が十分に分離された産物でよりシャープなピークが得られました（すべて 40 ˚C）。分離は 25 ˚C および 60 ˚C でも評価されましたが、サンプル成分ピークの最良のピーク形状と分離能が示されたのは 40 ˚C でした（図 36）。わずかな温度上昇でも、移動相の有機成分であるイソプロパノールに起因するシステム背圧が低減されました。

グラジエントのフォーカス

粗ペプチドの分析のために移動相モディファイヤーおよび温度を最適化した後、フォーカスグラジエントを用いて近くに溶出される夾雑物ピークの分離能を改善しました。4.6 × 50 mm のカラムの容量は 0.698 mL で、システム容量は 0.77 mL と測定されました。粗ペプチド分析に使用された HPLC メソッドを以下に示します：

グラジエント組成のポイントと検出器の間のオフセットを計算します

オフセット = システム容量 + カラム容量

例：
オフセット = 0.77 mL + 0.698 mL
オフセット = 1.468 mL

溶媒が検出器に到着する時間を計算します

検出器までの時間 =
オフセット（mL）/流速（mL/分）

例：
検出器までの時間 = 1.468 mL / 1.46 mL/分
検出器までの時間 = 1.00 分

ピーク溶出濃度が形成された時間を計算します

溶出濃度の時間 =
ピーク保持時間 – 検出器までの時間 – グラジエントホールド

例：
溶出濃度の時間 = 3.23 分 – 1.00 分 – 0.50 分
溶出濃度の時間 = 1.73 分

ピーク溶出（%）を計算します

溶出濃度（%）=
溶出濃度の時間/パイロットの長さ × 変化（パイロット）/ グラジエントセグメント +
最初のパイロットグラジエント（%）/ グラジエントセグメント

例：
溶出濃度（%）= 1.73 分 × 30% + 0% / 4.78 分
溶出濃度（%）= 10.85%

注：割合に関するすべての計算では、絶対値のみを使用します（つまり、0.30 × 1.73 ではなく 30 × 1.73 分）。

パイロットグラジエントの傾きをカラム容量あたりの変化率（%）で計算します。

# カラム容量 (CV) =
1 CV X 流速（mL） × グラジエントセグメント時間 × mL 分

例：
# カラム容量 = 1 CV × 1.46 mL × 4.78 分 / 0.698 mL 分
# カラム容量 = 9.99
パイロットグラジエントの傾き = パイロットグラジエントの変化（%）
# カラム容量

例：
パイロットグラジエントの傾き = 30% / 9.99 CV = 3.0% / CV

フォーカスグラジエントの傾きをカラム容量あたりの変化率（%）で計算します。パイロットグラジエントの傾きの 5 分の 1 を使います。

フォーカスグラジエントの傾き（%/CV）=
1/5 × パイロットグラジエントの傾き

例：
フォーカスグラジエントの傾き = 1 × 3.0% / 5 CV
フォーカスグラジエントの傾き = 0.6% / CV


フォーカスグラジエントのセグメントを推定溶出割合の 5% 以下から 3～5% 以上までで作成します。ピークはアセトニトリル 10.85% で溶出し、したがって、緩いグラジエントは6.37 分間で 5 ～ 13% のアセトニトリルから分析されるようにデザインしました。

フォーカスグラジエントセグメントの時間 =
変化率（%）× フォーカスグラジエントの傾き × カラム容量 × 流速（mL）

例：
フォーカスグラジエントセグメントの時間 = 8% / 0.6% × 0.698 mL / 1 CV × 1 分 / 1.46 mL
フォーカスグラジエントセグメントの時間 = 6.37 分


パイロット分析の最初の条件で開始し、ピークの溶出濃度（%）の 5% 以下まで直ちに上昇するフォーカスグラジエントを作成します。

フォーカスグラジエントを作成した後、粗ペプチドサンプルの分離を評価しました（図 37A）。小さな不純物ピークが産物ピークの直前に溶出されましたが、あまりはっきりとは認識できませんでした。負荷量を 2 倍にすると（図 37B、72 µg）、この不純物はよりはっきりと確認できるようになりましたが、メインピークは比較的高い純度を保っていました。元の負荷量 36 µg の 4 倍では、この不純物がより顕著になり、この負荷量を分取用の大きなカラムへと幾何学的にスケーリングした場合に高純度産物が得られる確率を低下させる可能性が高くなるクロマトグラムが得られました（図 37C）。分析カラムへの 256 µg の負荷量では、この不純物はメインピークと完全に共溶出されました（図 37D）。

分取へのスケールアップ

分析カラムへの負荷量 72 µg が分取スケールへの幾何学的スケーリングで選択されました。この控えめな負荷量では、最小注入量のスケーリングよりも少ない注入回数で適量の高純度材料が得られる確率が高くなります。質量負荷量はカラム容量と比例しており、Prep カリキュレーターを使用するか、以下の式で M2 を算出して決定します：

M1 はカラム 1 の質量負荷、M2 はカラム 2 の質量負荷です。
L1 はカラム 1 の長さ、d1 は直径であり、L2 はカラム 2 の長さ、d2 は直径です。

M2 = M1 × L2 / L1 X d2² / d1²
M2 = 72 μg × 100 mm / 50 mm × (19 mm)² / (4.6 mm)²

M2 = 72 μg × 36,100 / 1058
M2 = 2456 μg または 2.4 mg

粗ペプチドサンプル 44.03 mg を 5 mL の DMSO に溶解させ、ろ過しました（濃度 8.80 mg/mL）。4.6 × 50 mm の分析カラムへの 72 µg の負荷量の 19 × 100 mm の分取カラムへの幾何学的スケーリングでは、上で計算されたように 2.4 mg の注入が必要でした。粗ペプチド濃度 8.80 mg/mL で注入量を計算しました。

注入量 = 2.4 mg × 1 mL / 8.80 mg/mL
注入量 = 0.272 mL または 272 μL

分析スケールのフォーカスグラジエントを分取スケールにスケーリングし、両スケールでのシステム容量を考慮しました（表 4）。このデュエルボリュームは分取システムにしては大きく見えますが、これにはカラム加熱用の 5 mL プレヒーターループと 2 mL の注入ループが含まれています。これらの要因のシステム容量への寄与を考慮すると、残りのシステムチューブに起因する 2.75 mL は非常に妥当でした。生成されたピークは時間に基づいて回収しました（図 38）。

表 4.グラジェントスケーリング。

• カラム：4.6 × 50 mm カラム：19 × 100 mm
• システムデュエルボリューム：0.77 mL システムデュエルボリューム：9.75 mL
• カラム容量：0.698 mL カラム容量：23.804 mL
• システムデュエルボリューム（カラム容量単位）：1.10 システムデュエルボリューム（カラム容量単位）：0.41 グラジエントオフセット：0.66

フラクション分析

ペプチド産物ピークは 2 つのフラクションに回収されました。これらの 2 つのフラクションは、図 39 に示すように非常に高純度でした。フラクション分析およびブランク試料のそれぞれにおいて約 2.25 分で溶出した広いピークは、移動相中のイオン対形成トリフルオロ酢酸モディファイヤーからのものであると考えられます。TFA の疎水性成分は、通常カラムに蓄積し、グラジエント中に溶出します。カラムなしの別のブランク（図 40）ではクロマトグラムにピークが確認されなかったことから、この夾雑物はインジェクターやバルブなどのシステムコンポーネント由来ではありませんでした。

At-Column Dilution

ペプチドが高純度で単離されたとしても、注入あたりのサンプル負荷量を増やすことでプロセス効率が高まり、次の実験のために必要な産物量を精製するのに必要なクロマトグラフィー分析の回数が減ります。すでに説明したように、At-Column Dilution はシンプルなシステム接続の変更により、より多くのサンプル負荷量を非常に効果的に管理します（図 33）。

At-Column Dilution を用いたペプチド単離のカラム容量あたりの %B の変化率は、幾何学的にスケーリングした従来の分離で使用される分析法と同じでしたが、プログラムされたグラジエントテーブルは、サンプルロード用補助ポンプで導入された有機溶媒の寄与を含めるように調整されました（表 5）。

表 5.グラジエントの比較：従来法と At-Column Dilution 法。

グラジエント時間：14.40 – 1.66 = 12.74 分 グラジエント時間： 16.00 – 3.26 = 12.74 分
グラジエント容量：12.74 分 × 25 mL/分 = 318.5 mL グラジエント容量：12.74 分 × 25 mL/分 = 318.5 mL
カラム容量：318.5 mL × 1 CV/23.804 mL = 13.38 CV カラム容量：318.5 mL × 1 CV/23.804 mL = 13.38 CV
グラジエントの傾き：8%/13.38 CV = 0.6%/CV グラジエントの傾き：8%/13.38 CV = 0.6%/CV
グラジエント中のロード用ポンプの流速 = 1.25 mL/分
1.25 mL/分 = 合計流速の 5%
グラジエント法の合計流速 = 25 mL/分

At-Column Dilution ポンプは有機溶媒を直接サンプルループに導入し、合計流速の 5% で送液するようにプログラムされます。したがって、クロマトグラフィーポンプの流速は従来の分析法の 25 mL/分から At-Column Dilution 法の 23.75 mL/分へと低下します。合計流速は 25 mL/分（23.75 mL/分 + 1.25 mL/分）のままであることに留意してください。At-Column Dilution ポンプはインジェクターに直接接続されているため、サンプルをループからカラムに完全に移動させるのに十分な長さの最初の条件でのホールドステップがグラジエントの開始時に挿入されます。システムは 2 mL ループで構成されており、元のホールドステップは 0.66 分でした。

At-Column Dilution 法のホールドステップを計算します： 2 mL ループ × （1 分/1.25 mL） = 1.6 分
1.60 分 + 0.66 分（元の分取法のホールドステップ）= 2.26 分（At-Column Dilution 法のホールドステップ）。

グラジエント法の A および B の割合も At-Column Dilution ポンプの寄与を反映するために調整します。フォーカスグラジエントは 5% B で開始し、13% まで進みます。合計流速の 5% が At-Column Dilution ポンプによりイソプロパノールの一定流速 1.25 mL/分で送液されるため、At-Column Dilution 法における B の割合はそれぞれ 0% および 8%B とプログラムされます。At-Column Dilution 法は少し違う方法でプログラムされますが、実際のグラジエントは従来の分析法と同一です。このペプチドはこのように低い B の割合で溶出するため、5% B になっている実際の時間は At-Column Dilution 法では長くなり、従来の分取分析法において 0%B から 5%B へと変化するのにかかる時間が At-Column Dilution 法ではホールド時間に組み入れられます。本書をお読みの皆様に明確に示すために、At-Column Dilution 法では別々のラインでこれらの 2 つのステップをプログラムします。At-Column Dilution ポンプで送液される 5% B の相当分として B の割合を低下させるため、元の従来の注入法と同じグラジエントを保持するには A の割合を必ず 5% 増やさなければなりません。クロマトグラフィーシステムの注入シーケンスに洗浄ステップが含まれる場合は、すべての洗浄ラインがプライミングされ、洗浄用強溶媒で満たされていることを確認してください。

幾何学的にスケーリングした大規模の単離は 40 ˚C で実施したため、At-Column Dilution を用いる注入でもこの温度を保ちました。溶媒プレヒーターループは、水性溶媒流の Tee の直前に挿入しました（図 41）。

次に、溶媒プレヒーターループ、Tee、カラムをウォーターバスに沈めました。グラジエント分離を開始する前に、圧力が安定化するまで待ちましたが、これはシステム平衡に達したことを意味します。ペプチド 2.4 mg が従来の接続構成を用いて注入できたサンプル最大量でしたが、At-Column Dilution 構成のシステムではその 5 倍量である 12 mg（1.36 mL）をカラムに導入しました（図 42 および 43）。フラクションは時間に基づいて回収し、その後、元の 0 ～ 30% B のスクリーニング法を用いて分析しました。これらのフラクションでは高い純度が確認され、従来の注入法を用いた分取で回収されたフラクションと同等でした（図 44）。

疎水性ペプチドのための特別な考察

12 の非極性アミノ酸残基および 3 つの極性無電荷アミノ酸残基で構成される疎水性ペプチドをジメチルスルホキシドに溶解しました。以下の分取用フォーカスグラジエントを、従来の分析用に接続されたクロマトグラフィーシステムにおいて 19 × 100 mm カラムでの単離に使用しました。このペプチドは極端な疎水性を持っていたため、流速を減らし、サンプル負荷量を減らし、温度を 60 ˚C にする必要がありました。

このペプチドは At-Column Dilution の使用に適した候補ですが、カラムへの質量負荷量を増やすことで析出のリスクが発生します。ペプチドは約 50% のアセトニトリルで溶出するため、このサンプルを必要な溶出強度をかなり下回る 5% B（前の例と同じ）でロードすると、カラムヘッドで希釈されるためペプチドが析出しやすくなります。ローディングステップにおいてクロマトグラフィーポンプから送られる有機溶媒の割合を高めることで、析出の問題が発生する可能性が低下します。一般的に、極端に疎水性の高い化合物の場合、化合物溶出が予測される割合の 20 ～ 25% 以下である有機溶媒の初期割合をグラジエント法で用いることで、At-Column Dilution 法のメリットを活かしながらサンプル析出を予防できます。以下の調整した At-Column Dilution グラジエントを用いて 5 倍量のサンプルを 19 × 100 mm カラムにロードしました（図 45）。

グラジエントは 48.6% B（43.6% B + At-Column Dilution ポンプからの 5% B）で開始し、カラム容量あたり 0.49% の変化率で 29 分に 53% アセトニトリルで終了しました。これは従来の注入で使用されるグラジエント変化率と同じです。At-Column Dilution ポンプは 100% アセトニトリル中のペプチドサンプルを 5 mL ループから Tee に送り、そこで初期条件 23.6% B（18.6%B + At-Column Dilution ポンプからの 5% B）のクロマトグラフィーポンプの移動相と合流させました。分析法の開始時の 9.2 分間のホールドにより、サンプルは完全にカラムにロードされました。At-Column Dilution ポンプは一定流速 0.8 mL/分で送液しました。この流速は合計流速 16.3 mL/分の 5% でした。

低分子の分離に使用されるか高分子の分離に使用されるかにかかわらず、カラムは定期的に、洗浄する必要があります。高い背圧、高いクロマトグラフィーバックグラウンドおよびサンプルが原因ではない外来ピークはすべて、カラムの洗浄が必要であることを示しています。

カラム内での汚染物質の蓄積を予防することがカラムの寿命を延ばす最良の方法です。すべてのサンプルを注入前にろ過することが推奨されます。カラムの前にインラインフィルターやガードカラムを追加すると、微粒子やその他の不要な混合成分を捕捉するのに役立ちます。各分離の後にカラム容量の 2 ～ 3 倍量の高濃度の有機溶媒でカラムを洗浄することは、不要な汚染物質を系統的に除去するのに有用です。最後に、At-Column Dilution はサンプルを溶液中に溶解した状態に保ち、高圧によるシステムの停止を予防し、最終的な行き先がフラクション回収チューブなのか廃液容器なのかにかかわらずサンプル成分を精製システムに効率的に通過させます。

突然発生した高い背圧は、サンプルループ、チューブ、カラムまたは検出器フローセルなどのシステム内のどこかでのサンプル析出に起因する可能性があります。クロマトグラフィーシステムの接続では、HPLC フィッティングを廃液ラインから流れと反対にポンプに向かって系統的に緩めていくことで、高圧の原因を明確に特定します。背圧が徐々に上昇するのは、複数回の注入後のカラム内の不純物の蓄積の結果であると考えられ、さまざまな方法で改善することができます。高温で高速グラジエントを繰り返し実行したり、カラムを高濃度の有機溶媒で長時間洗浄したり、DMSO や 1 ～ 10% のギ酸のような「洗浄用溶媒」を注入したりすることで、カラム内の不要な汚染物質を除去することができます（図 46）。

最終製品に混入しアレルギー反応を引き起こす可能性のある内毒素多糖をカラムから除去する脱パイロジェンの場合、一般に 1 M の水酸化ナトリウムでの 1 時間以上にわたる強力な洗浄が必要となります。この手順は現在のカラムとは適合性がありません。