Primer sulla Spettrometria di Massa

I solventi sono in genere scelti in base alla solubilità di un composto di interesse e alla compatibilità con le varie tecniche di ionizzazione utilizzate nella LC-MS. La volatilità e la capacità del solvente di cedere un protone sono importanti nelle tecniche ESI e in altre tecniche di ionizzazione a pressione atmosferica.

Vengono utilizzati solventi primari protici come il metanolo e le miscele con acqua, per esempio metanolo/acqua 1:1 o acetonitrile/H₂O 1:1 (sebbene la miscela acqua/metanolo aumenti la viscosità ben oltre l’acqua o il mentolo come solvente puro a causa di una reazione esotermica risultante). La pressione di vapore relativamente bassa dell’acqua può essere dannosa per la sensibilità se utilizzata al 100%. Si ottiene una sensibilità migliore quando la tensione superficiale viene ridotta tramite l’aggiunta di un solvente organico volatile. Anche i tensioattivi con maggiore affinità protonica, pur aumentando la liberazione di ioni da parte delle goccioline nebulizzate, possono ridurre la sensibilità.

I co-solventi aprotici come il 10% di DMSO in acqua e l’alcol isopropilico migliorano la solubilità di alcuni composti. L’acido formico viene spesso aggiunto a bassi livelli (0,1%) per facilitare la ionizzazione, garantendo che l’analita sia più basico del solvente. Anche in piccole quantità, tuttavia, alcuni acidi, come il TFA, sebbene siano necessari per composti altrimenti insolubili, possono limitare la sensibilità.

Nella modalità di ionizzazione ESI, tamponi e sali (Na⁺, K⁺ e fosfato) provocano una riduzione della pressione di vapore e, di conseguenza, una riduzione del segnale. È possibile risolvere l’aumento della tensione superficiale delle goccioline e la conseguente riduzione della volatilità utilizzando tamponi relativamente più volatili come l’acetato di ammonio, formato da una coppia acido-base debole.

Considerazioni sui solventi

• Il solvente in fase gassosa limita la ionizzazione da parte di ESI alle molecole più basiche del solvente. L’eccezione è la fotoionizzazione (che non è una ionizzazione acido/base), ma ciò nonostante è mediata dal solvente.
• La rimozione di solvente e vapore acqueo dalla regione di ionizzazione aumenta i tipi di composti che possono essere ionizzati a pressione atmosferica.
• La riduzione del volume del liquido rispetto al campione o all’analita di interesse contenuto nel liquido migliora le prestazioni ESI (ovvero, velocità di flusso inferiori).
• Solventi Utili
  • Acqua
  • Acetonitrile
  • Metanolo
  • Etanolo
  • Propanolo
  • Isopropanolo
• Additivi accettabili
  • Acido acetico
  • Acido formico
  • Idrossido di ammonio
  • Formiato di ammonio (concentrazione salina = 10 mM o inferiore)
  • Acetato di ammonio (concentrazione salina = 10 mM o inferiore)
• Sali non volatili (fosfato, borato, citrato ecc.)
  • Possono depositarsi nei capillari della sorgente e dell’otturatore, richiedendo quindi maggiori operazioni di pulizia e manutenzione
  • I moderni modelli di sorgenti sono in grado di gestire meglio i solventi non volatili rispetto ai vecchi modelli
• I tensioattivi (tensioattivi/detergenti) sopprimono la ionizzazione per elettronebulizzazione
• Gli acidi inorganici sono corrosivi
• Acido trifluoroacetico (TFA)
  • Sopprime in una certa misura l’elettronebulizzazione a ioni positivi a livelli superiori a 0,01%.
  • Elettronebulizzazione a ionizzazione negativa fortemente soppressa.
• Trietilammina (TEA)
  • Un valore PA elevato (232 Kcal/mole) produce uno ione [M+H]+ intenso a m/z 102
  • Sopprime l’elettronebulizzazione a ioni positivi di composti meno basici.
• Tetraidrofurano (THF)
  • Il 100% di THF è altamente infiammabile, pertanto la tecnologia APCI e la maggior parte delle tecniche di interfaccia utilizzano l’azoto come gas di nebulizzazione. (L’utilizzo di aria crea il rischio di esplosione).
  • Reagisce con i tubi in PEEK.

Soppressione Ionica e Scelta delle Fasi Stazionarie

La soppressione ionica è uno dei problemi più visibili che devono affrontare gli spettrometristi che utilizzano ESI come tecnica di ionizzazione. La pubblicazione della Food and Drug Administration (FDA) americana, Guidance for Industry on Bioanalytical Method Validation (Federal. Register, 66, 100, 28526) nel 2001 indica la necessità di tale considerazione per garantire che la qualità dell’analisi non sia compromessa. L’articolo riporta diversi protocolli sperimentali per la valutazione della presenza di soppressione ionica. Si confronta la risposta di controllo delle reazioni multiple (MRM) (aree o altezze dei picchi) dell’analita in un campione post-estrazione addizionato con quella dell’analita iniettato direttamente nella fase mobile pura. Un basso segnale dell’analita nella matrice rispetto al solvente puro indica la presenza di interferenze.

Una pubblicazione di C. Mallet et al. descrive dove sono presenti gli effetti della matrice del cromatogramma sull’analita (e sullo standard interno). Gli sperimentatori utilizzano un flusso continuo di una soluzione standard contenente l’analita di interesse e il suo standard interno aggiunti all’effluente della colonna. Dopo l’iniezione di un estratto di bianco nel sistema LC, un calo della linea di base costante indica la soppressione della ionizzazione dell’analita a causa della presenza di materiale interferente.

Fasi Stazionarie delle Colonne

Un cambiamento nella tecnologia è stato l’avvento delle fasi stazionarie delle colonne ibride e delle particelle altamente selettive di diametro inferiore a due micrometri. Le fasi ibride si basano meno sui modificatori della fase mobile, che possono causare la soppressione ionica, e aumentano la selettività delle particelle.

Confronto tra LC ad altissima pressione e HPLC tradizionale

La recente commercializzazione del lavoro del prof. J. Jorghenson (University of North Carolina), spesso indicata genericamente come UHPLC (Ultra High Pressure Liquid Chromatography), aumenta il potenziale delle informazioni derivate da analisi LCMS tipiche. Commercializzato da Waters Corporation come UPLC, o Ultra Performance Liquid Chromatography, l’aumento della capacità di picco rispetto all’HPLC rende possibile la definizione di entità chimiche che altrimenti avrebbero co-eluito sotto i picchi più ampi dell’HPLC. Concentrando i picchi in bande di ampiezza (in genere) pari o inferiore a due secondi si aumenta il rischio di incremento della sensibilità in quanto favorisce la risposta dello spettrometro di massa ai miglioramenti nel rapporto segnale-rumore.

L’idea alla base della UPLC modifica parametri familiari stabiliti nella pratica di separazione tradizionale come velocità di flusso, dimensioni delle particelle, persino il nostro apprezzamento delle curve di van Deemter. All’aumentare della pressione operativa da ~2000 psi fino a un massimo di 20 000 psi, i diametri delle particelle inferiori a 2 µm si avvicinano al limite teorico descritto nel 1969 da John Knox nella sua “Equazione di Knox”. Una volta risolti i problemi associati all’aumento dello stress meccanico e agli effetti termici eccessivi, i miglioramenti nelle prestazioni della MS sono una conseguenza in qualche modo controversa della teoria.

Vedere anche:

• C.R. Mallet, Z. Lu, and J.R. Mazzeo, A study of ion suppression effects in electrospray ionization from mobile phase additives and solid-phase extracts, Rapid Commun. Mass Spectrom. Vol 18, 1, 49–58 2004.
  • Perché è importante: attività a cui si fa spesso riferimento sui confronti tra SPE.
    
• L.L. Jessome, D. A. Volmer, Ion Suppression: A Major Concern in Mass Spectrometry, LCGC, Vol 24, 5 maggio 2006
  • Perché sono importanti: fornisce una discussione esaustiva su uno dei principali ostacoli incontrati nella tecnica ESI: le modifiche dell’affinità protonica in fase gassosa che incidono sulla quantificazione.
    
• Toyo’oka, Toshimasa, Determination Methods for Biologically Active Compounds by Ultra-Performance Liquid Chromatography Coupled with Mass Spectrometry: Application to the Analyses of Pharmaceuticals, Foods, Plants, Environments, Metabonomics, and Metabolomics, Journal of Chromatographic Science, Vol 46, 3, marzo 2008, pp. 233-247
  • Perché è importante: fornisce una panoramica completa delle pubblicazioni relative alla moderna pratica cromatografica.
    
• U. Neue, Theory of peak capacity in gradient elution, J Chromatogr A. 2005 Jun 24;1079 (1-2):153-61.
  • Perché è importante: discussione contemporanea sulla pratica cromatografica moderna.
    
• J. H. Knox and M. Saleem, Kinetic Conditions for Optimum Speed and Resolution in Column Chromatography, J. Chromatogr. Sci., 7 (1969) 614-622
  • Perché è importante: uno dei documenti fondamentali che prevede la pratica cromatografica moderna.