Primer sulla Spettrometria di Massa

Elettroionizzazione (EI)

Molti hanno familiarità con l’elettroionizzazione (EI).(A volte viene utilizzata l’espressione precedente “impatto dell’elettrone”, sebbene, tecnicamente, non sia corretta). EI, spesso eseguita esponendo un campione a 70 eV di elettroni, è indicata come tecnica “forte”. L’energia degli elettroni che interagiscono con la molecola di interesse è generalmente molto maggiore di quella contenuta nei suoi legami, quindi si verifica la ionizzazione. L’energia in eccesso rompe i legami in modo ben caratterizzato. Il risultato sono frammenti prevedibili e identificabili dai quali è possibile dedurre l’identità della molecola. L’estrazione di un solo elettrone dal guscio esterno produce un catione radicalico in modalità positiva (M.+) e un ricco spettro di frammenti. A differenza delle tecniche di ionizzazione a pressione atmosferica più “soft” che producono una risposta spettrale a volte caratteristica del particolare design della sorgente del produttore, la tecnica EI è abbastanza indipendente dal design della sorgente. Uno spettro prodotto da uno strumento EI è molto simile a uno spettro dello stesso composto di un altro strumento EI, un fatto che si presta alla creazione di librerie spettrali per abbinare gli spettri sconosciuti agli spettri di riferimento.

Ionizzazione chimica (CI)

Molecole che frammentano eccessivamente richiedono tecniche “soft”. La ionizzazione chimica (CI) produce ioni tramite un processo di trasferimento dei protoni più delicato che preserva e promuove l’aspetto dello ione molecolare stesso. Il campione è esposto a un eccesso di gas reagente, come quello che si sviluppa quando il metano forma lo ione molecolare protonato (M+H). Il processo inverso può produrre ioni negativi. Il trasferimento del protone alla molecola del gas può, in alcuni casi, produrre lo ione negativo (M-H).

La ionizzazione chimica (CI) viene talvolta utilizzata per composti con caratteristiche chimiche simili a quelli analizzati da EI per migliorare l’abbondanza o l’aspetto dello ione molecolare a favore di una frammentazione significativa. Analogamente a quanto accade per EI, i campioni devono essere termicamente stabili poiché il riscaldamento nella sorgente provoca la vaporizzazione. Il meccanismo di ionizzazione della CI si basa su EI per la fase iniziale di ionizzazione, ma all’interno della sorgente è presente un reagente chimico gassoso, come metano, isobutano o ammoniaca, ad alta pressione. Il gas reagente, che è presente a una concentrazione molto più elevata rispetto all’analita (R), viene ionizzato mediante ionizzazione elettronica per fornire ioni reagenti R+. primari. La collisione di ioni R+. con molecole R neutre porta alla formazione di ioni secondari stabili che sono le specie reagenti che ionizzano le molecole dell’analita (A) tramite reazioni ione-molecola.

Per esempio la reazione ione-molecola tra uno ione metano e una molecola di metano dà luogo alla specie CH₅⁺ abbastanza stabile.

CH₄^+. + CH₄  --> CH₅⁺ + CH₃^.

Lo ione reagente CH₅⁺ può ionizzare molecole di analita neutre (A) tramite trasferimento di protoni, estrazione di idruri o scambio di carica.

RH⁺ + A --> R + AH⁺ (trasferimento di protoni)

(R-H)⁺ + A --> R + (A-H)⁺ (estrazione di idruri)

R+^. + A --> R + A^+. (scambio di carica)

Le reazioni di ionizzazione più comuni sono le protonazioni, favorite per le molecole con affinità protonica superiore a quella del reagente. L’estrazione dell’idruro è comune per le molecole a bassa affinità protonica e lo scambio di carica avviene con reagenti ad alta energia di ionizzazione.

La sostanza da analizzare si trova a una pressione nettamente inferiore a quella del gas reagente. Se si considera il metano come gas reagente, l’impatto degli elettroni provoca principalmente la ionizzazione del metano. Questo si frammenta in parte in CH₃⁺. Queste specie sono quindi soggette a reazioni di molecole ioniche alle alte pressioni della sorgente impiegate.

CH₄^+. + CH₄  --> CH₅⁺ + CH₃^.

CH₃⁺ + CH₄  --> C₂H₅⁺ + H₂

CH₅ ⁺ può agire come un acido di Bronsted e C₂H₅⁺ come un acido di Lewis per produrre ioni dall’analita.

Un’attenta scelta del gas reagente CI può migliorare il trasferimento di carica a una molecola di analita poiché l’acidità della fase gassosa del gas di ionizzazione chimica influenza l’efficienza del trasferimento di carica. In CI è più probabile che l’analita produca uno ione molecolare con frammentazione ridotta che conserva l’energia normalmente internalizzata in EI per rompere i legami.

Ionizzazione Chimica a Ioni Negativi (NCI)

Una variante, la ionizzazione chimica negativa (NCI), può essere eseguita con un analita che contiene gruppi che catturano gli elettroni (per esempio, atomi di fluoro o gruppi nitrobenzilici). La sensibilità può essere aumentata di molte volte (in alcuni casi è stata riportata da 100 a 1000 volte) rispetto a quella dell’EI. NCI è applicabile a un’ampia varietà di piccole molecole che sono (o possono essere) modificate chimicamente per promuovere la cattura di elettroni.

Nel caso degli ioni negativi esistono due meccanismi principali per la produzione di ioni negativi: la cattura degli elettroni e la ionizzazione chimica degli ioni reagenti. In condizioni di CI le molecole elettronegative possono catturare elettroni termici per generare ioni negativi. La vera ionizzazione chimica a ionizzazione negativa avviene per reazione di un composto analita (AH) con ioni reagenti a carica negativa (R^-. o R^-). Possono verificarsi diversi tipi di reazioni ione-molecola, la più comune delle quali è l’estrazione di protoni.

AH + R^-  --> A^- + RH

All’aumentare dell’affinità protonica (basicità) dello ione reagente, è più probabile che si verifichi l’estrazione del protone.

Gascromatografia (GC)

Forse il primo incontro con uno spettrometro di massa per molti è come il rivelatore per un gascromatografo. La gamma di tipi di strumenti GC-MS si è ampliata per trascendere i limiti dei modelli precedenti di strumenti o per soddisfare la legislazione sempre più rigorosa in applicazioni quali analisi ambientale, screening per la sicurezza alimentare, metabolomica e applicazioni cliniche come analisi forensi, tossicologiche e screening dei farmaci.

In passato, due tipi di spettrometri di massa dominavano l’analisi GC-MS: gli strumenti a settore magnetico e gli strumenti a quadrupolo singolo. La prima, che offriva alta risoluzione e analisi di massa accurate, era utilizzata in applicazioni che richiedevano estrema sensibilità. La seconda era impiegata in analisi di routine dei composti target.

Le analisi GC-MS più complesse sono state riservate agli strumenti del settore magnetico: diossine in campioni ambientali/industriali o screening per l’uso illecito di sostanze dopanti nello sport agonistico. I livelli di rivelazione in ordine di femtogrammi, ad alta risoluzione/selettività, sono facilmente ottenibili con gli strumenti a settore magnetico.

Poco dopo la loro introduzione, i sistemi GC-MS a quadrupolo sono stati accettati nelle applicazioni di analisi dei target. I metodi USEPA hanno imposto l’uso di strumenti GC-MS a quadrupolo per analizzare i campioni alla ricerca di numerosi contaminanti ambientali. Poiché tali applicazioni richiedono solo livelli di rivelazione da picogrammi a nanogrammi, la minore sensibilità del quadrupolo rispetto al settore non costituisce una limitazione. Al contrario, il costo notevolmente ridotto, la facilità d’uso e la portabilità si sono rivelati provvidenziali.

Cromatografia Liquida (LC)

La tecnologia rivoluzionaria che ci ha consentito l’accesso analitico a circa l’80% dell’universo chimico irraggiungibile dalla GC è anche responsabile della fenomenale crescita e dell’interesse per la spettrometria di massa negli ultimi decenni. Sono stati individuati alcuni soggetti (vedere la sezione “Breve storia”) per l’associazione tra LC e MS. A partire dagli anni ’70, il sistema LCMS come lo conosciamo oggi si è evoluto fino a raggiungere la piena maturità all’inizio degli anni ’90. Molti dei dispositivi e delle tecniche che usiamo oggi in pratica sono tratti direttamente da quel tempo.

La cromatografia liquida è stata definita all’inizio del 1900 dal lavoro del botanico russo Mikhail S. Tswett. I suoi studi si sono concentrati sulla separazione dei pigmenti fogliari estratti dalle piante utilizzando un solvente in una colonna impaccata con particelle. Nella sua forma più semplice la cromatografia liquida si basa sulla capacità di prevedere e riprodurre con grande precisione le interazioni concorrenti tra analiti in soluzione (fase mobile o condensata) che vengono fatti passare su un letto di particelle impaccate (fase stazionaria). Negli ultimi anni lo sviluppo di colonne impaccate con una varietà di gruppi funzionali e di sistemi di erogazione dei solventi in grado di erogare con precisione la fase mobile ha consentito alla LC di diventare la struttura portante dell’analisi per molti settori.

L’acronimo HPLC è stato coniato da Csaba Horváth nel 1970 per indicare che l’alta pressione è stata utilizzata per generare il flusso necessario per la cromatografia liquida in colonne impaccate. Da allora, i continui progressi nelle prestazioni, incluso lo sviluppo di particelle più piccole e una maggiore selettività, hanno visto anche il significato dell’acronimo cambiare in cromatografia liquida ad alte prestazioni.

Nel 2004, ulteriori progressi nella strumentazione e nella tecnologia delle colonne hanno consentito di ottenere significativi incrementi di risoluzione, velocità e sensibilità nella cromatografia liquida. Le colonne con particelle più piccole [1,7 micron] e la strumentazione con funzionalità speciali progettate per erogare fase mobile a 15 000 psi [1000 bar] sono note come tecnologia UPLC, che rappresenta il termine differenziato di cromatografia liquida UltraPerformance. Molto di ciò che è contenuto in questa tecnologia attuale è stato previsto da ricercatori come John Knox negli anni ’70. Knox ha previsto che il diametro ottimale delle particelle sarebbe pari a 1-2 m e che la cromatografia sarebbe termicamente sensibile al calore per attrito. La tecnologia in grado di sviluppare piccole particelle robuste e uniformi è stata necessariamente affrontata e risolta durante lo sviluppo di UPLC per un uso diffuso. Scoprite un buon primer su HPLC e UPLC.

Elettronebulizzazione (ESI)

Il termine generale “ionizzazione a pressione atmosferica” (API) include la tecnica più importante, la ionizzazione per elettronebulizzazione (ESI), che a sua volta fornisce la base per varie tecniche correlate in grado di creare ioni a pressione atmosferica anziché nel vuoto. Il campione viene disciolto in un solvente polare (in genere meno volatile di quello utilizzato con il sistema GC) e pompato attraverso un capillare in acciaio inossidabile che trasporta tra 2000 e 4000 V. All’uscita dal capillare a pressione atmosferica il liquido si aerosolizza; le goccioline di desolvatazione rilasciano ioni che fluiscono nello spettrometro di massa, indotti dagli effetti combinati dell’attrazione elettrostatica e del vuoto.

Il meccanismo attraverso il quale i potenziali trasferimenti dal liquido all’analita, creando ioni, rimane un argomento controverso. Nel 1968, Malcolm Dole ha proposto per la prima volta il meccanismo di carica residua in cui ha ipotizzato che quando una goccia evapora, la sua carica rimane invariata. La tensione superficiale delle gocce, che alla fine non è in grado di opporsi alle forze repulsive della carica imposta, esplode in molte gocce più piccole. Queste fissioni coulombiane si verificano finché non rimangono goccioline contenenti un singolo ione di analita. Quando il solvente evapora dall’ultima gocciolina, si forma uno ione in fase gassosa.

Nel 1976, Iribarne e Thomson hanno proposto un modello diverso, il meccanismo di evaporazione ionica, in cui piccole gocce si formano per fissione coulombiana, in modo simile al modo in cui si formano nel modello di Dole. Tuttavia, secondo la teoria dell’evaporazione ionica, l’intensità del campo elettrico sulla superficie della gocciolina è sufficientemente elevata da rendere energeticamente favorevole agli ioni solvatati l’uscita dalla superficie della goccia e il trasferimento direttamente nella fase gassosa.

È possibile che i due meccanismi lavorino di concerto: il meccanismo di carica residua è dominante per masse superiori a 3000 Da mentre l’evaporazione ionica è dominante per masse inferiori, vedere R. Cole, Some tenets pertaining to Electrospray ionization mass spectrometry, J of Mass Spec, 35, 763–772 (2000).

Il liquido del cromatografo liquido entra nella sonda ESI in stato di equilibrio di carica. Pertanto, quando il solvente lascia la sonda ESI, trasporta una carica ionica netta. Per garantire che la tecnica ESI sia una tecnica continua, la soluzione deve essere caricata tramite reazioni elettrochimiche in base alle quali gli elettroni si trasferiscono su una superficie conduttiva che funge da elettrodo. Tra gli altri effetti, questo processo può portare a variazioni di pH. Si presuppone che, in modalità positiva, goccioline con carica positiva lascino il getto nebulizzato e che gli elettroni siano accettati dall’elettrodo (ossidazione). (Il contrario sarebbe vero in modalità negativa.) L’area superficiale dell’elettrodo elettroattivo, l’entità della corrente, la natura delle specie chimiche e i relativi potenziali dell’elettrodo esercitano tutti un effetto.

Nel complesso, l’ESI è un processo efficiente. Tuttavia, l’energia di attivazione e la differenza di energia per la reazione, in totale, per le singole specie varia. La velocità di flusso della soluzione e la corrente applicata definiscono i limiti per ciascuna goccia. Si verifica concorrenza tra molecole e la soppressione di analiti di interesse non è infrequente.

Estensioni della teoria di base della ESI, come la riduzione del liquido a volumi estremamente bassi, per esempio a 30 nL/min nel caso della nanospray, si sono dimostrate efficaci, in particolare negli studi su proteine e amminoacidi con campioni limitati.

Ionizzazione Chimica a Pressione Atmosferica (APCI)

Anche se il lavoro dimostrativo APCI è stato pubblicato in parallelo con quello dimostrativo ESI, APCI non è stato ampiamente adottato fino alla commercializzazione di ESI, che si è verificata sulla scia del lavoro di Fenn nel 1985.

Horning ha introdotto per la prima volta l’APCI nel 1973 per analizzare i composti volatili utilizzando varie tecniche di introduzione, una delle quali era l’HPLC. La funzionalità aggiuntiva APCI consente di ottenere analiti che resistono alla conversione in ioni in fase gassosa mediante ESI, ovvero quelli meno polari e più volatili introdotti in uno spettrometro di massa da un flusso in fase condensata, o liquido. A differenza di ESI, APCI trasferisce analiti neutri nella fase gassosa vaporizzando il liquido introdotto in un flusso di gas riscaldato. La ionizzazione chimica si basa sul trasferimento di specie cariche tra uno ione reagente e una molecola target per produrre uno ione target che può essere sottoposto ad analisi di massa. Più comunemente, in modalità a ionizzazione positiva, si forma un addotto tra la molecola target e lo ione H⁺ piccolo, sebbene siano comuni anche gli addotti con i sali. Per esempio, si può formare l’addotto di ammonio (M+NH₄)⁺ quando il sale acido-base debole, l’acetato di ammonio, è presente nella fase mobile, un modificatore spesso utilizzato al posto del tampone fosfato meno volatile e altamente ionico. A concentrazioni saline più elevate, la concorrenza tra la forma protonata e quella con addotto ammonio può produrre una risposta ridotta per entrambe. Il numero massimo di ioni che possono essere formati da APCI è molto maggiore di quanto non sia in ESI perché gli ioni del reagente si formano in modo ridondante. Il liquido viene spinto attraverso un tubo non conduttivo, in genere di vetro di silice, intorno al quale scorre un gas nebulizzato. Le goccioline fini risultanti collidono con la parete interna riscaldata di un tubo o di una sonda che si estende oltre l’estremità del tubo non conduttivo e vengono quindi convertite nella fase gassosa. Questo tipo di ionizzazione viene spesso eseguito a velocità lineari molto maggiori rispetto a quelle dell’HPLC o delle velocità di flusso per cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC) normalmente associate all’elettronebulizzazione. Gli strumenti moderni, tuttavia, offrono capacità di desolvatazione molto maggiori, migliorando le prestazioni di tutte le tecniche che dipendono dall’aerosol.

Le molecole dell’analita desolvatate vengono quindi ionizzate tramite ionizzazione chimica. Il potenziale ionizzante viene applicato non attraverso il liquido come nella ESI, ma sulla punta di un ago come plasma, o corona, attraverso il quale passano le goccioline. In effetti, la fase mobile funge da intermediario per il trasferimento della carica all’analita. Da qui il nome precedente ad APCI: “elettronebulizzazione mediata da solvente”.