使用450 Å二醇基键合BEH色谱柱和荧光检测以体积排阻色谱法分析腺相关病毒(AAV)制剂

本应用纪要介绍了一种优化的体积排阻色谱(SEC)方法，可以在非变性条件下分离几种CMV-GFP对照AAV血清型的可溶性AAV自缔合形式和片段，包括AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9。

优势

• 优化几种AAV血清型的SEC分离
• 分离低价多聚体和二聚体AAV HMWS和AAV LMWS
• 使用内在荧光检测提高信噪比，AAV上样量和浓度要求低

随着基因治疗产品的研发速度加快，开发稳定高效的分析策略，为生产工艺的开发和临床用腺相关病毒(AAV)载体的质量评估提供指导变得越来越重要。在诸多关键质量属性中，可能有必要监测高分子量物质(HMWS)所代表的潜在AAV聚集体和低分子量物质(LMWS)所代表的AAV片段水平¹。本文介绍了一种优化的体积排阻色谱(SEC)方法，可以在非变性条件下分离几种CMV-GFP对照AAV血清型的可溶性AAV自缔合形式和片段，包括AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9²。

散装AAV8-Null和AAV8-GFP对照样品由BioReliance（马里兰州罗克维尔）提供。各种AAV血清型样品购自Vigene Biosciences（马里兰州罗克维尔），使用PBS配制溶液。BEH450 SEC蛋白质混标使用500 μL含有10 μg/mL L-色氨酸(Sigma)的PBS重悬。

在开发AAV的SEC分离方法时，识别SEC的分析物大小上限非常重要，该值低于亚可见范围，可检测的粒径上限约为100 nm。当聚集体大小超过100 nm时，可能会在SEC条件下发生破坏，或被筛板或色谱柱的填充床捕集。因此，筛分100 nm以上的物质通常需要使用一些补充方法，例如动态光散射和纳米颗粒跟踪分析(NTA)等^3,4。还需要注意的是，亚可见聚集体形式水平显著增加与SEC图谱观察到的低价聚集体（如二聚体和三聚体）增加可能并不是同时发生的。

考虑到这些因素，我们利用平均孔径为450 Å (45 nm)的二醇基键合BEH SEC色谱柱评估了AAV单体、二聚体、低价多聚体以及低分子量形式的SEC分离。平均孔径为450 Å的SEC颗粒通常不足以对分子量近4000 KDa的蛋白质以及分子量约1500 KDa的ssDNA分析物进行SEC分离。然而，由于直径为25 nm的AAV结构紧凑，预测这种具有较大孔隙体积的高效SEC颗粒可提供所需的分离，颗粒孔径大于平均孔径，使大部分HMWS都可以穿过该空隙体积。此外，虽然最初的方法开发使用的是填充2.5 µm粒径颗粒、内径为4.6 mm的色谱柱，但为了尽量减少潜在的样品筛分效应，最终方法选择了更大的3.5 μm粒径、7.8 mm内径的色谱柱。

鉴于许多AAV制剂样品的浓度较低，且现阶段开发的生产工艺产量较低，导致SEC所需的进样量较小，因此我们还采用了内在蛋白荧光检测以尽可能提高灵敏度。与紫外吸收相比，内在蛋白荧光还有一个额外优势：AAV的DNA含量变化不会对响应因子造成太大影响⁵。

基于可用性考虑，方法开发最初使用的是AAV8-Null对照样品。空白对照样品是不含DNA的AAV衣壳。使用Wyatt microDAWN多角度光散射检测器(MALS)和ACQUITY RI（示差折光）检测器评估了通过磷酸盐缓冲液流动相（PBS，含有10 mM磷酸钠和150 mM NaCl）完成的分离（图1）。SEC-MALS数据证实，二聚体和单体AAV形式之间实现分离。此外，使用FLR也在二聚体之前观察到假定的多聚体形式，但由于丰度较低，无法通过MALS分配分子量。

本研究采用了单因素优化方案，以PBS为起始流动相，尽可能提高聚集体的回收率并减少单体衣壳的峰拖尾。该方案先在保持离子强度恒定(150 mM NaCl)的情况下评估pH值，然后使用Auto•Blend Plus技术在观察到的最佳pH值下评估离子强度⁶。 最后评估了盐类型（NaCl、KCl和高氯酸钠）和其他添加剂（精氨酸和异丙醇）。最终发现由20 mM磷酸钠(pH 6.6)和150 mM KCl组成的流动相可为AAV8-Null对照样品提供出色的分离。为节省样品，我们选择这种单因素优化方案来代替更严格的全因素方法开发方案。但应注意，在确定最佳方法条件时通常首选全因素优化方案，因为单因素优化方案也许只能提供局部优化。在部署本研究所述方法分析含有DNA的AAV血清型(CMV-GFP)时，观察到在不同血清型中，使二聚体和多聚体回收率获得大幅提升的最佳KCl浓度各不相同。血清型AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9的最终方法条件和色谱图见图2。

我们观察到，二聚体HMWS和单体AAV形式的峰形对称，并且适当地返回基线。此外，可检测水平的HMWS的保留时间与在几种血清型中观察到的AAV多聚体形式一致。仅在AAV9血清型中观察到大量LMW形式，在AAV6中含量更低。如前所述，为提高该方法对低丰度高分子量和低分子量形式的灵敏度，我们使用了内在蛋白荧光检测。然而，在评估SEC蛋白质混标时，由于量子产率较低，未能观察到小分子总渗透体积标记物（尿嘧啶）。能够跟踪SEC色谱柱的总渗透体积在SEC方法开发中非常有用，因为在这种情况下，总渗透体积后持续存在的任何FLR信号均表明蛋白质被过度保留在色谱柱上。因此，建议向标准品中添加10 μg/mL的L-色氨酸标记总渗透体积，该氨基酸是使用内在蛋白质荧光检测时，蛋白质的主要荧光基团（图3）。

本研究证明，平均孔径为450 Å、粒径为3.5 μm的BEH-SEC色谱柱能有效分离AAV单体与它的HMW二聚体、低价多聚体和LMW片段。不同血清型获得最佳峰形和回收率所需的最小离子强度(KCl)不同，本研究报告了血清型AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9的水平。虽然450 Å平均孔径可能被认为达不到理想的分析物分离效果，但结果表明，这些颗粒的大孔径和高效率能够有效分离分析物。有人提出，AAV HMWS分离主要是由孔径450 Å以上的颗粒分布驱动的。此外，可以使用内在蛋白荧光检测提升AAV样品的方法灵敏度。

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4. Slutter, B.; Jiskoot, W. Sizing the Optimal Dimensions of a Vaccine Delivery System: a Particulate Matter.Expert Opinion on Drug Delivery.2016, 13, 167-170.
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致谢

本文作者由衷感谢BioReliance提供AAV-8 null样品和AAV-8 GFP样品。