一种简单快速混合模式SPE联合UPLC-MS/MS用于法医毒理学研究中镇痛药物和滥用药物分析的综合性方法

本应用纪要介绍了一种将固相萃取与UPLC-MS/MS分析结合用于法医毒理学中镇痛药物和滥用药物分析的综合性方法，并强调了该方法的许多优势。

样品制备流程经过优化，可通过简单的步骤高效萃取所有分析物，减少了手动步骤的数量。吸附剂的水可浸润性支持孔内样品预处理和直接上样，无需活化和平衡，省去了样品转移步骤并避免了潜在的转移错误。实验证明具有高回收率、一致的基质效应以及准确而精密的定量数据，可实现高效且可重现的萃取。

使用ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱可快速分析大型分析物组，同时保持准确定量所需的基线分离。

Waters Xevo TQ-S micro采用StepWave技术和XDR检测器，可确保在宽动态范围内对所有化合物进行极其快速而准确的定量分析。该方法能够同时定量分析2 ng/mL的6-MAM和2500 ng/mL的甲基苯丙胺。

此优化工作流程集样品制备、UPLC分离和MS/MS检测为一体，获得了一种快速、准确且精密的方法。

优势

• 综合性药物组的样品制备过程简单、快速
• 所有分析物都能高效获得一致的回收率
• 具有一致的基质效应
• 所有样品预处理和萃取均在孔内完成，免除转移步骤
• 能够在4分钟内完成对80种化合物的LC-MS/MS分析
• 所有化合物均能获得准确、精密的定量数据

在法医毒理学分析中，分析物组通常包括违禁药物和常见的滥用药物。通常，研究人员使用多种法医毒理学方法获取多种药物的全面信息。这些方法可包括免疫分析、GC-MS、LC-MS/MS或组合方法。沃特世开发了一种用于定量分析综合性药物组的方法，以获得适当的分析灵敏度、选择性和准确度，从而在法医毒理学中实现明确鉴定。

该方法采用Oasis MCX μElution板和ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱，通过简单的样品萃取方案以及快速、可重现的色谱方法，使所有存在潜在干扰的关键分析物对均能实现基线分离。Waters Xevo TQ-S micro具有Xtended Dynamic Range (XDR)功能，能够提供多种化合物所需的分析灵敏度和动态范围。

所有标准品均购自Cerilliant（德克萨斯州圆石）和Cayman Chemical（密歇根州安阿伯）。用甲醇配制浓度为2、10和25 µg/mL的混合储备液，具体取决于分析物种类。用甲醇配制浓度为1 µg/mL的内标储备液。所有化合物均使用稳定同位素标记的内标，但纳曲酮、甲氧非君、去氢去甲氯胺酮、间羟基苯甲酰芽子碱、α-吡咯烷基苯戊酮(α-PVP)代谢物1、甲丙氨酯、氟西泮、去甲丙氧芬和氯硝西泮除外。对于上述化合物，某些内标会干扰其他某种分析物的定量分析（例如纳曲酮和氯硝西泮），或者不易得到稳定同位素标记的内标。通过将储备液稀释到混合空白尿液中制得样品。外部质控样品购自UTAK Laboratories（加利福尼亚州瓦伦西亚）。表1列出了所有分析物的保留时间和校准范围。

按照文献¹。 使用分析物的响应因子计算经内标校正的基质效应。

SPE萃取

将100 µL尿液加入Oasis MCX μElution板的各个孔中，然后加入100 µL包含水解缓冲液、10 µg/mL β-葡糖醛酸酶和100 ng/mL内标的溶液，并抽吸几次以充分混合。孵育后，加入200 µL 4% H₃PO₄，并抽吸几次以充分混合。利用真空将所有样品直接吸入吸附床中，随后用200 µL 80:20水:甲醇进行清洗。在高真空环境（约15英寸汞柱）下将板干燥1分钟，尽可能除去清洗溶液。用每次25 µL含5%浓氨水(Fisher, 28%~30%)的50:50 乙腈:甲醇溶液对萃取板洗脱2次。进行LC-MS/MS分析之前，用150 µL样品稀释剂（2%乙腈:1%甲酸的MilliQ水溶液）稀释所有样品。该萃取方案的工作流程图如图1所示。

色谱分析

表1中列出了所有测试目标化合物的保留时间和校准范围。图2所示为采用ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱执行分析获得的分析物组中所有化合物的色谱图。甲丙氨酯和去甲丙氧芬包括在分析物组中，但只进行了定性监测，因为它们与样品制备流程不完全兼容。与任何多分析物组一样，必须注意确保化合物与内标不发生相互干扰。图3A和3B突出显示了几组可能相互干扰的分析物的色谱图。在所有示例中，要么实现了基线分离（参见图3B的纳洛酮与6-MAM），要么MRM不发生相互干扰（参见图3A的去氢去甲氯胺酮和乙基酮）。在某些情况下，未使用特定的内标。 

例如，未使用氯硝西泮-d4，因为它会干扰劳拉西泮的定量分析。UPLC色谱柱的高柱效使所有化合物能够在短短3分钟内洗脱，且不影响该大型分析物组的分离度，总运行时间为4分钟。

回收率和基质效应

所有萃取技术的目标都在于使所有相关分析物获得高效、可重现的回收率。与此前的研究工作一样，对传统MCX技术的清洗方案进行了改进，以适应苯二氮卓类药物的分析²。 图4显示了来自六批不同尿样的整组化合物的平均萃取回收率。除甲丙氨酯和去甲丙氧芬以外，所有化合物（MDMA和EDDP除外）的回收率均高于70%。萃取效率也具有一致性。所有定量化合物的变异系数(%CV)均小于10%。各批次的回收率数据符合相同的模式。分析不同批次基质获得的高效回收率证明了萃取技术的稳定性，并且对于定量分析不同来源样品中的这些化合物非常重要。

此外，还使用多批尿样对基质效应进行了评估。与回收率一样，一致的基质效应对于准确定量至关重要。图5A显示了六批尿样的聚集基质效应。大多数分析物均观察到离子抑制效应，其中吗啡和氢化吗啡酮的离子抑制效应高达60%。然而，仅两种化合物除外（间羟基苯甲酰芽子碱和α-羟基咪达唑仑），其由基质效应引起的标准偏差小于20%，表明基质批次间性能一致。图5B显示了使用内标校正后的基质效应。在这种情况下，78种化合物中有75种化合物的基质效应经校正后小于20%。

定量分析

在表1中所示的浓度范围内，提取七个数据点绘制校准曲线。调整校准范围，以反映各种化合物的预期浓度。在校准品浓度范围内制备四个浓度的质控样品，其最低浓度为校准品最低浓度的1.5倍，最高浓度为校准品最高浓度的75%。对于大多数化合物，上述QC浓度为15、75、250和750 ng/mL。对于浓度较低的化合物，其QC浓度为3、15、50和150 ng/mL；对于较高浓度的化合物，其QC浓度为37.5、187.5、625和1875 ng/mL。定量方法验证包括在五天内绘制完整曲线和配置QC样品。绘制两份校准曲线，且每天配制6个重复QC样品。各个校准品和QC样品的控制限值为目标值±15%，但最低浓度点除外，其控制限值为目标值±20%。QC样品的精密度限值对于最低浓度点的QC样品为20%，对于其他浓度点为15%。甲丙氨酯和去甲丙氧芬仅进行了定性评估，不受这些控制限值的影响。五次单独萃取和分析的汇总结果符合上述所有标准，可参见附录2。大多数化合物的浓度在其目标值的10%范围内，且%CV低于10%。对于批次内结果，所有化合物均满足准确度标准，唯一一种精密度结果大于15%的化合物是高浓度安非他命QC样品，其精密度结果为18%。

所有校准曲线均符合FDA生物分析方法验证要求₃，其中要求所有校准品浓度均在目标值的15%范围内（最低浓度点除外，其结果必须在目标值的20%范围内）并且75%的校准品满足该标准。所有化合物均满足上述标准，且所有曲线的R²值均为0.99或更高。 

定量限是指信号值高于萃取的基质空白五倍以上、信噪比高于10并且偏差和%CV均小于20%的点。要评估定量限，需在一个验证批次中对最低浓度的校准品重复萃取六次。所有化合物均符合上述标准。

还对仪器稳定性进行了评估。在八天内萃取并分析一批样品五次。在四天内，所有化合物均符合上述定量验证标准。

为评估准确度，对购自UTAK Laboratories的外部质控样品进行了评估。评估结果列于表2A–2D中。使用外部质控样品评估的分析物包括阿片类药物、苯二氮卓类药物、兴奋剂和合成卡西酮。这些结果表明，98种化合物中有91种化合物(93%)的结果在目标值的20%范围内。由于芬太尼、去甲芬太尼和丁丙诺啡等化合物采用小体积（20 μL储备液）加标的方式进行制备，因此这些分析物存在较大偏差的原因，可能是制备混合储备液母液时发生了一点错误。此外，7-氨基氯硝西泮在尿液基质中可能存在稳定性问题，导致其偏差较低。所有结果的%RSD值均小于10%。

本应用纪要介绍了一种固相萃取联合UPLC-MS/MS分析用于法医毒理学研究中违禁药物和滥用药物分析的综合性方法，并强调了该方法的许多优势。

• 样品制备流程经过优化，可通过简单的步骤高效萃取所有分析物，减少了手动步骤的数量。吸附剂的水可浸润性支持孔内样品预处理和直接上样，无需活化和平衡，省去了样品转移步骤并避免了潜在的转移错误。实验证明具有高回收率、一致的基质效应以及准确而精密的定量数据，可实现高效且可重现的萃取。
• 使用ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱可快速分析大型分析物组，同时保持准确定量所需的基线分离。
• Waters Xevo TQ-S micro采用StepWave技术和XDR检测器，可确保在宽动态范围内对所有化合物进行极其快速而准确的定量分析。该方法能够同时定量分析2 ng/mL的6-MAM和2500 ng/mL的甲基苯丙胺。

此优化工作流程集样品制备、UPLC分离和MS/MS检测为一体，获得了一种快速、准确且精密的方法。

1. Zhang, X., J.P. Danaceau, E. Chambers: Quantitative analysis of THC and its metabolites in whole blood using LC-MS/MS for Toxicology and Forensic Laboratories.Waters Application Note 720005769, 1–7 (2016).
2. Danaceau, J.P., E. Chambers: 通过简化混合模式样品制备策略对尿液样品中的苯二氮卓类药物和Z-drugs进行LC-MS/MS分析.沃特世应用纪要 720005973ZH, 1–9 (2017).
3. Bansal, S., A. DeStefano: Key elements of bioanalytical method validation for small molecules.The AAPS Journal 9(1), E109–E114 (2007).