制备型液相色谱入门指南
制备型液相色谱(LC)简介
色谱是根据混合物中各组分的化学特性对其进行分离的一种分离方法。制备型(Prep)色谱或纯化色谱则是指利用色谱方法分离出一定量达到足够纯度的化合物用于后续实验或处理的过程。科学家首先要确定目标化合物，然后开发色谱方法，将目标化合物从原料、副反应或其他杂质中成功分离出来。其总体目标是满足日益增长的高通量和高效率需求，同时运用各种纯化技术达到相应的规模、纯度和重现性要求。
从大型制药企业到小规模天然产物研究团队，纯化色谱在众多科研机构中应用非常广泛。尽管应用领域各不相同，用户的一般要求却非常相似，他们都希望分离出的终产物纯度能达到95%或更高。
本入门指南旨在为液相色谱工作者介绍快速发展的LC纯化领域，内容包括色谱分离方法开发、方法放大所需的数学公式以及常用的馏分收集模式等基本原理。鉴于大多数制备型LC应用都使用反相分离模式，本指南将主要介绍该分离模式。
采用液相色谱进行纯化
LC纯化系统的配置与一般液相色谱系统相同，但增加了馏分收集器。样品混合物被进样至色谱柱，色谱柱根据组分特有的化学或物理性质对其进行分离。检出组分时，系统会将其输送至废液，或者进行收集用于后续实验。洗脱液收集操作既可由分析人员在组分洗脱时通过简单的手动方式完成，也可以全自动进行，在自动收集操作中，检测器信号会触发馏分收集器将液流输送至收集容器中。输送至收集容器的馏分纯度取决于分离过程中化合物与其他邻近洗脱杂质的分离度。
图1.制备型LC系统。
判断纯化分离成功与否的标准包括通量、回收率和所得分离物的纯度。纯化分离由色谱峰的分离或“分离度”驱动。以下是对分离度有显著影响的主要色谱参数：
- 色谱柱填料（固定相）
- 溶剂强度
通过执行方法开发工作流程，可确定实现理想分离度的条件。该工作流程非常简单，但包含多个步骤，各步骤的复杂性和必要性根据样品的独特性质而异。无论样品分离用于何种应用、采用哪种模式（即反相色谱、离子交换色谱等），方法开发工作流程通常都是相同的。
图2.通用制备型工作流程。
在设计工作流程之前，首要考虑因素是目标化合物的性质。如果从熟知的来源或新来源中分离已知化合物，很容易通过检索相关文献获取有关目标化合物色谱行为的信息，并从已发表的方法中选择适用的分离方法。而对于含有未知类型化合物的粗提取物，设计分离方案的难度较大。在这种情况下，可在初始分离之后进行一系列探索性实验，获取更多有关目标化合物的信息，例如pKa、分子量、溶解性、稳定性、UV光谱和生物活性等。然后根据这些信息修改初始分离方法，使其符合化合物的化学和物理性质要求。这些信息不仅有助于方法开发，还可以在收集到馏分之后，为掌握目标产物的稳定性提供非常大的帮助。
第一步要制备样品并使用快速探索梯度执行常规分离。这一步通常为小规模分离，目的是节省宝贵的样品。根据该分离的结果，可以计算洗脱目标化合物的溶剂条件并进一步优化分离条件，从而尽可能提高分离度。此外，可能还需要对上样量进行研究，确定可维持适当分离度以实现高纯度分离的理想上样量。
确定分离方法和理想上样量后，通常要针对具有应用前景或潜在价值的分离物进行方法放大（但并不是必须执行）。在本入门指南中，术语“规模”(scale)旨在描述满足产物纯度、通量和收率等应用目标所需的仪器和方法。若要“放大”(scaled-up)方法，则需要将方法转换至硬件配置可处理更高上样量的系统。从本质上来讲，方法放大就是借助一系列方法放大计算和硬件更改，在分离度保持不变的前提下，将方法从分析级内径色谱柱转换到制备级内径色谱柱的过程。
图3.用于分析级和制备级纯化的色谱柱内径对比。
样品
可用于分离特定化合物的样品来源十分广泛，包括药物中间体、天然产物、保健食品、饮料和工业产品等。只要原料可以进行提取并溶解于液体基质中，就可以使用色谱纯化其中的各组分。
样品提取技术的选择取决于待提取原料的复杂性。对于天然产物，通常将样品干燥并研磨成细颗粒用以提高提取效率。接下来采用渗滤（用于大体积样品）或浸提（用于小体积样品）等技术提取目标化合物。这两种技术都需要向样品原料中加入溶剂，然后在超声、涡旋或浸泡后收集溶质。收集提取物之后，和所有HPLC样品一样，样品在进样前必须过滤，以除去颗粒并排除气泡。
分离模式
制备型色谱主要有四种分离模式：反相、正相、凝胶渗透和离子交换。合适的分离模式取决于待分析样品、提取物或混合物与固定相和溶剂之间的相容性。
反相色谱是开发纯化方法时最常用的技术，其使用极性弱于洗脱溶剂极性的固定相。反相色谱使用水与乙腈或甲醇的混合物作为洗脱液，其中还会添加缓冲液（酸或碱）用于控制样品的离子化程度以及结合固定相中未反应的游离硅醇基团。硅胶基质固定相中的键合相材料或吸附剂采用甲硅烷基化试剂进行了衍生化处理，可减少峰拖尾并提高色谱重现性。上述衍生化试剂处理（硅烷化）以及不同的碳载量将赋予不同制造商的色谱柱独特的分离特征。
快速启动方法开发
建立反相分离方法时，通常选择小规格的分析型色谱柱（内径≤4.6 mm），并且其柱长和填料应可扩展至较大规格（内径≥10 mm）内径的色谱柱，以便将来放大方法。方法开发的关键是找到可实现理想分离的适用溶剂体系。对于酸性化合物，通常采用pH值为酸性的水性流动相，并以甲醇或乙腈作为强溶剂。浓度为0.1%的甲酸是常用的缓冲液添加剂，因为其兼容UV和质谱检测。如需鉴定未知化合物或获取纯分离物用于进一步研究，MS兼容性将非常有用。如需让碱性分子保持未电离状态，可使用pH值为碱性而非酸性的流动相。使用任何pH值的缓冲液之前，都应参阅色谱柱固定相说明书了解其兼容性。
水性流动相通常由位置A处的泵泵送，强溶剂由位置B处的泵泵送。本入门指南将分别使用“A”和“B”指代泵表中的水性溶剂和强溶剂。
