肽分离实用方法
简介
肽在新型候选药物的开发中发挥着独特作用，填补了传统小分子治疗药物与大分子蛋白质治疗药物之间的专业技术空白。肽类药物的疗效和安全性均优于小分子药物，在人体内的耐受性也更高，此外，其工艺复杂性和生产成本低于蛋白质类生物药物，作为一种有望应用于治疗多种疾病的候选药物，肽类药物受到越来越多的关注。合成肽可用于研究细胞基质间的结构-活性关系，其本身也是具有疗效的药物。无论是采用固相肽合成工艺、溶液相肽合成工艺，还是从天然产物中分离，几乎所有粗制肽混合物都相当复杂且需要进行纯化。即使小心控制合成反应，也会不可避免地形成杂质，产物中还可能含有结构缺失、截断或序列经过化学改性的变体（如裂解加合物或处理过程中形成的其他副产物）。
近年来，分析方法方面的技术进步对肽作为诊断技术和新兴治疗药物的应用起到了推动作用。采用先进仪器运行分析方法可有效提高灵敏度和分离度并缩短运行时间，这些优势均有助于我们在生产过程中节省大量时间。
有关合成肽的一大棘手问题是分离方法的开发。对于未来研究，纯度和目标肽产率是影响实验结果的关键因素。如前文所述，合成肽在合成、裂解和去保护过程中可能会产生数量相当多的杂质。应用分析级HPLC的方法开发原理可改善肽产物的分离效果。开发制备级纯化方法运用的分离机制与开发小规模方法时需遵循的原则相同。色谱柱和流动相改性剂的选择、温度控制以及梯度优化是开发任何分离方法时都必须考察的内容。通过系统方法开发流程开发肽分离方法可显著提高产物纯度和收率。传统的肽分离通常采用UV引导的色谱方法，而将质谱引导的分离方法与严谨的方法开发流程相结合，可以更加明确地区分目标肽与合成及裂解过程中形成的污染物，从而使纯化过程变得更加轻松。
肽纯化过程的要求
任何分离策略的目标都是在尽可能短的时间内纯化尽可能多的样品，同时达到后续实验所要求的纯度。对于需要合成多种肽的典型实验室而言，制定适用于大部分样品并且可根据需要进行简单优化的标准纯化方案将十分有用。若能在改变流动相组成、改性剂或柱温时确保运行间的性能保持一致，将省去设置多组色谱柱的时间。这种提高收率和纯度的方式既经济又直接，且易于实施。理想的肽纯化方案还会使用能兼顾分析级和制备级分离的稳定仪器。对于流速范围较广的通用型仪器，仅通过改用直径匹配分离目标的色谱柱就能提高纯化效率。综合考量上述各因素可降低肽纯化的整体成本。
肽分离工作流程
肽分离标准方案（图1）的第一步是确定后续实验要求达到的肽纯度。通过粗制肽分析可合理估算样品纯度，结合该结果与后续研究所需的纯肽量即可估算出载样量。载样量将决定制备色谱柱的规格，继而会决定选定LC仪器的流速。
图1.肽分离工作流程。
粗制肽分析完成之后的步骤是将方法几何放大至具有相同填料的大规格色谱柱上用于分离。图2中的放大公式展示了在不同规格色谱柱之间转换分离方法时，色谱柱直径、柱长、载样量和流速之间的关系。梯度斜率表示为单位柱体积对应的溶剂变化百分比，而非单位时间内溶剂变化的百分比，可确保梯度方法从初始条件到最终条件的各个步骤输送的柱体积数量始终相同，从而保持分离度一致。制备级方法必须包括一段用于模拟系统延迟的起始条件保持时间，具体将通过小规模分离确定，同样以柱体积数量表示。制备型色谱分离完成后，将对收集到的馏分进行分析评估。纯肽的后续处理应遵循用户指南。
图2.放大公式。
肽分离完全可以采用配备泵、进样器、UV检测器和馏分收集器的简单液相色谱系统进行（图3）。虽然并不是肽分离必须采用的技术，但质谱检测可鉴定目标肽并减少分离之后需要进行分析的馏分数量。无法电离或难电离的化合物通常采用短波长UV检测。相反，UV吸光性极差的肽通常可由MS轻松检出。
图3.液相色谱系统基本组成示意图。
纯化过程注意事项
分离模式
由于不同肽的特性各异，分离可用的色谱模式也有许多选择。尽管反相色谱是目前应用最广的肽分离模式，但使用离子交换色谱或体积排阻色谱等替代选择方法来分离某些肽会更加高效。这些替代技术也可与反相色谱联用，制定专用于棘手样品的两步分离方案。
反相色谱
反相色谱因其重现性好、适用性广的优势被广泛应用于多种类型化合物的分离，其中也包括肽的分离。非极性的C18-键合硅胶是相当常用的一类反相色谱柱填料。反相色谱流动相通常由水和可与水混溶的极性有机溶剂（例如乙腈或甲醇）组成，这种流动相会根据化合物极性从C18色谱柱上洗脱化合物。因此，肽本身的疏水性越强，它在C18色谱柱上的保留性就越好。
虽然C18是相当常用的反相填料，但其他一些键合相（C4、C8、RP18、苯基等）也可与基质颗粒键合，为优化化合物分离提供替代选择性。硅胶是最早问世的反相色谱柱填料之一，但硅胶基质填料会限制分离速度、分离度、pH、温度耐受性以及色谱柱载样量。采用获专利的*杂化颗粒技术开发的新型色谱柱基质颗粒能够在更高的流速、温度和pH下运行，同时提高选择性、分离度、重现性并延长色谱柱寿命。
*美国专利号6,686,035 B2
离子交换
离子交换色谱从很早开始就被用于蛋白质及其他生物制剂的分离。由于组成肽的氨基酸带有正电或负电，因此可采用离子交换色谱进行肽分离。经过官能化的天然聚合物树脂（如琼脂糖）和合成聚合物（如聚甲基丙烯酸甲酯(MMA)，或苯乙烯-二乙烯苯共聚物）是大分子分离的常用介质，因为这些填料可承受大规模生物处理的工艺周期和批次之间极为严苛的清洁处理。上述工艺采用的氢氧化钠溶液会损坏小分子和小规模肽分离常用的硅胶基质填料。
离子交换剂可分为四种：弱阴离子交换剂、弱阳离子交换剂、强阴离子交换剂和强阳离子交换剂。阳离子交换模式用于保留并分离带负电表面上的正电荷离子，而阴离子交换模式则用于保留并分离带正电表面上的负电荷离子。强阴离子和强阳离子交换色谱柱可在较宽的pH范围内(2–12)完全离子化，而弱离子交换色谱柱只能在较窄的pH范围内(9.5–5.5)离子化。
相较于阴离子交换模式，阳离子交换模式更常用于肽分离，但具体选用哪种模式取决于肽序列。在pH小于3的条件下进行肽分离时，氨基酸侧链羧基上的负电将被中和，同时N-端基团质子化，使得肽带上正电荷，进而被吸引至阳离子交换色谱柱上的负电位点（图4）。
图4.肽被阳离子交换色谱柱填料吸引。
反之，对于适合在pH 6-10的条件下进行分离的肽，应采用阴离子交换模式。在较高pH条件下进行阴离子交换时，肽上的羧基带负电，因此会被吸引至阴离子交换色谱柱上的正电位点（图5）。
图5.肽被阴离子交换色谱柱填料吸引。
为应用离子交换技术的肽分离方法选择色谱柱和进行方法开发时，应遵循几条一般建议。阴离子和阳离子交换模式均可使用，基本原则是：分离酸性肽采用阴离子交换模式，分离碱性肽采用阳离子交换模式。对于某些肽，可能需要反向运用该原则（尤其是分子量较大的肽），但必须通过调节pH使肽所带的净电荷与填料所带的电荷相反。
无论极性如何，强交换剂都是肽色谱分离的首选。肽的带电情况是序列和带电侧链所处微环境共同作用的结果。针对具体的肽序列，可通过小幅调整流动相pH来调节分离的选择性。选择性的小幅调整不会影响强离子交换剂的结合能力。
离子交换分离是作为两步纯化方案中的第一步还是作为单步分离方案用于制备实验材料，会影响流动相和操作条件的选择。如果离子交换分离的产物将通过反相色谱进一步纯化，则可以采用蛋白质离子交换方案常用的缓冲液和洗脱条件，例如使用磷酸盐或Tris缓冲液并采用氯化钠梯度进行洗脱。产物中的盐将通过后续步骤去除。
如果要通过离子交换法一步得到可用的肽，应谨慎选择可通过冻干去除的挥发性缓冲液。甲酸铵是理想选择，因为它具有分别对应铵盐和甲酸盐pK值的两个缓冲区域。甲酸铵既可在pH 3-4的条件下用于碱性肽的阳离子交换色谱分离，又可在pH 9.25-10.25的条件下用于酸性肽的阴离子交换色谱分离。在pH恒定的条件下，可利用甲酸铵浓度逐渐升高的离子强度梯度来洗脱目标肽。另一方面，利用pH梯度进行洗脱则能够省去通过冻干去除高离子强度缓冲液的耗时操作。同样地，甲酸铵缓冲液是很好的起始缓冲液。采用阴离子交换剂分离酸性肽时的洗脱梯度为pH从高到低，采用阳离子交换剂分离碱性肽时的洗脱梯度则为pH从低到高。
体积排阻色谱
根据分子大小进行色谱分离的技术如今被称为体积排阻色谱(SEC)，该技术可追溯至20世纪50年代。这种分离技术基于分子大小进行色谱分离，而非基于分子的带电情况或极性等化学特性，过去也被称作凝胶过滤或凝胶渗透色谱(GPC)。具有特定孔径分布的固定相颗粒可阻止大于柱床孔穴的样品分子进入，从而使其快速洗脱出来，小分子则会进入孔穴中并深入更复杂的结构，洗脱速度较慢。因此，大分子最先洗脱，小分子则根据其在溶液中的大小以降序顺序洗脱出来（图6）。SEC是一种低分离度技术，采用等度方法且运行之间无需进行平衡。色谱柱载样量取决于样品体积和浓度，而这两个因素都会影响分离度。
图6.体积排阻色谱样品洗脱过程。
SEC有时会作为初始净化步骤用于去除截断序列、去保护不彻底的肽以及其他杂质。随着合成肽的序列长度增加，上述污染物的数量也会大幅增加。在反相分离之前执行任何简单的初始纯化步骤都有助于简化色谱分离。SEC还可用于缓冲液更换，也就是将当前溶解肽的缓冲液更换为更适合后续实验或纯化步骤的其他缓冲液或溶液。
总结
肽分析和分离可采用多种不同的色谱技术，包括反相色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱。半制备级分离（分离量为几毫克至几百毫克）通常采用反相色谱技术。本文后续部分将围绕肽分离展开，重点介绍可利用哪些相关因素和技术对应用反相色谱分析和纯化肽的方法进行优化。
