GPC基本化学原理

体积分离简介

凝胶渗透色谱(GPC)也称为体积排阻色谱(SEC)，其原理在所有液相色谱技术中最容易理解。分离严格基于样品在溶液中的大小，且不会像常规HPLC分析一样，与色谱柱填料发生相互作用（吸附、分配等）。分离模式并非基于分子量，而是基于所分析材料（通常是聚合物）在溶液中的大小。换言之，为正确进行GPC分析，样品必须溶解于合适的溶剂。

溶液中的样品浓度取决于分子量，但分子量约100,000的聚合物的浓度通常为0.10% (w/v)。（更多信息请参阅下文的“样品制备”小节）。有时，必须加热样品溶液才能溶解样品。例如，一些聚烯烃需要在120 °C以上才能溶解，并且通常会在140 °C下才能溶解于1,2,4-三氯苯。

样品适当溶解后，即可通过进样机制引入色谱柱组，这些色谱柱用作分子过滤系统。色谱柱填充有交联凝胶（例如，用于有机应用的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物），其中含有表面孔隙。这些孔隙有大有小，用作上文提到的分子过滤器。体积较大的分子无法进入较小的孔隙。相反，较小的分子将进入大部分孔隙，保留时间更长。

几十年前，沃特世的首批GPC示范之一是口香糖分析。口香糖实际上是合成橡胶加上风味物质、稳定剂等添加剂。

此处展示了在串联连接的多个不同孔径的色谱柱上分离得到的原始GPC色谱图。聚合物（在本例中为橡胶）先洗脱，因为它的分子最大，随后是“添加剂”，按分子从大到小的顺序洗脱。该图也可以表示PVC与增塑剂、抗氧化剂和UV稳定剂混合物的色谱图。

单体、低聚物、聚合物和分子量分布

单体具有单一分子量，且被认为具有单分散性，例如乙烯、苯乙烯、氯乙烯等。在单体之后，还有二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等，它们统称为低聚物，到更高分子量时，则称为聚合物。聚合物具有链长分布，因此具有分子量分布。根据聚合过程的不同，分子量分布可能很窄，也可能很宽。例如，缩合或逐步增长聚合的聚合物，如聚酯（聚对苯二甲酸乙二醇酯），其分子量分布相当窄。另一方面，自由基聚合可产生链长和分子量分布很宽的聚合物（如聚烯烃）。控制聚合动力学对于获得所需的分子量分布至关重要。因此，GPC对聚合物分析人员而言是一种非常重要的技术。

此处显示了聚合物（在本例中为聚苯乙烯）两种分子量分布的叠加图：

获得聚合物样品的分子量分布后，就需要一种方法来进行定量分析。通过简单的统计分析来分配该分布范围内的平均分子量。每个切片都具有高度（Hi，也表示为浓度，Ci）、保留时间和分子量(Mi)值。通过校正曲线计算分子量（请参见下一小节）。接下来进行求和，得出描述聚合物分子量分布的各种平均分子量。所示PD为重均分子量和数均分子量的比值，称为多分散系数，有时简称为聚合物的分散性。这种求和只是获得这四个分子量统计矩和描述分子量分布的一种简单方法。

还可以采用其他技术获得这些平均分子量：

• 数均分子量(Mn)可通过膜渗透压法或端基分析（滴定、NMR等）获得
• 重均分子量(Mw)可通过光散射法获得
• Z均分子量(Mz)和Z + 1均分子量(Mz + 1)可通过超速离心法获得

完成GPC系统的校正后，即可通过单次进样获得所有这些平均分子量。

配置GPC系统

现在我们已经了解了平均分子量的全部内容，可以开始建立系统了。

系统（如上所示）由泵、手动或自动进样器、色谱柱组、检测器和数据处理设备组成。此外，最好使用脱气机，尤其是在配备示差折光检测器的系统上使用THF时。色谱柱几乎总是会加热到一定的高温，即使对于室温可溶性应用也是如此，这样做是为了确保低压降和粘度均匀。下面，我们将详细介绍该系统。

溶剂管理器

当前沃特世GPC系统使用的泵是非常精密的流体处理设备。就Alliance系统中使用的流路系统而言，它实际上是一种溶剂管理器。在选择用于GPC分析的流路模块时，需要考虑的最重要的因素是流速精度。我们使用保留时间（或体积）与分子量对数的关系图对系统进行校正。任何微小的流量波动都可能会导致分子量测定出现重大偏差，使用能够精确控制流量的设备是明智之选。与仍在使用的一些低流速精度的传统泵相比，此泵将大大提升平均分子量测量结果的精度。Alliance系统使用的溶剂管理器可使流速精度明显低于0.075%，且无需任何流速校正！市面上的一些泵声称具有相似的流速精度，但需要通过软件进行流速校正。如果要组合一套GPC系统，请警惕市面上那些精度规格为0.3%（甚至更差）的泵。

Alliance系统溶剂管理器还能够提供出色的梯度和流速设定性能。许多聚合物表征分析人员意识到，除了确定聚合物的分子量分布以外，复合添加剂的分析也很重要。在许多情况下，与用于制造产品的聚合物一样，复合添加剂与成品的成功应用密切相关。添加剂在主制剂中的任何错误混合（例如，抗氧化剂不正确或增塑剂含量不正确）都可能导致物理特性和性能不合格。为成功表征复合添加剂，我们进行了反相梯度HPLC分析。除了聚合物添加剂分析以外，我们还定期通过GPC（检查低聚物分布）和梯度HPLC（表征异构体和杂质）对环氧树脂和酚醛树脂进行分析。借助Alliance系统，您能够在一套系统上同时进行高性能GPC和梯度分析。

样品管理器

配置系统的下一步是确定我们想要如何引入标准样和样品以进行分离。花费最少的方法是使用手动进样器。您可以手动填充定量环（已知体积）并打开一个阀，让溶液流与洗脱液流一起流入色谱柱组中。如果只是偶尔运行几个样品，这种方法是不错的选择。但是，如果每天运行多个样品，则最好考虑使用自动进样器。

目前室温GPC分析最常用的自动进样器是2707自动进样器。您可以使用这款全电动自动进样器设置整个样品盘的样品，以便进样器在分析期间无人值守地运行。进样器的进样体积准确性和重现性出众，这对于分子量敏感型检测器的质量数测量至关重要（如使用粘度计或光散射检测器），此类检测器必须清楚确切的载样量。另一个可选的自动进样器是Alliance系统。该系统带有五个不同的样品转盘，每个转盘最多可容纳24个样品（总样品容量为120个样品）。

色谱柱选择

找到合适的溶剂来溶解聚合物，并以正确的浓度制得窄分布标准样和样品后，即可开始分析。我们选择了正确的色谱柱组进行分析（或者我们是否做到了这一点？），因此我们已经准备就绪。但是，请先回顾一下选择正确色谱柱组的步骤。

许多人喜欢使用过去所谓的“线性”色谱柱，也称为“扩展范围”或“混合床”色谱柱。这些色谱柱使用混合孔径，目的在于使色谱柱覆盖的分子量范围比单一孔径色谱柱更宽。如果孔的混合做得足够仔细，色谱柱校正曲线确实可以呈线性。

与使用单一孔径的色谱柱相比，这些混合床色谱柱的缺点是，在一定的分子范围内分离度较低。例如，如果您正在运行一系列环氧树脂或酚醛树脂，假设分子量范围为几百到五千，您会使用哪种色谱柱组？首先要考虑的是，色谱柱组中需要有足够大的孔隙体积以实现正确的分离，即获得正确的聚合物分布特征曲线。一根色谱柱肯定不够，两根色谱柱可能仍然不够。分析人员应使用至少三根串联的色谱柱，以确保获得足够大的孔隙体积，从而实现成功分离。

现在，我们将使用哪些色谱柱来分析环氧树脂或酚醛树脂？我们是否应使用具有混合孔径的“混合床”色谱柱组？还是应该使用具有一系列单一孔径的色谱柱以真正涵盖目标分子量范围？下表列出了填充苯乙烯/二乙烯基苯填料的各单一孔径色谱柱的分离分子量范围（基于聚苯乙烯链长排阻限，孔径以Å为单位）：

关于色谱柱还有其他注意事项。如果您查看GPC溶剂指南，会注意到其中展示了典型的操作温度范围。在GPC分析中，我们几乎总是将色谱柱加热至溶剂指南中所示的某个高温（即使对于室温应用也是如此）。加热色谱柱的目的不是为了溶解样品，而是为了提高分离度，加强渗透过程，以及在某些情况下降低溶剂（例如DMF）的粘度和色谱柱组的反压。 

检测器选项

如今，在GPC分析中使用最广泛的检测器是示差折光检测器。它是一种浓度敏感型检测器，可以简单地测量参比侧的洗脱液与样品侧的样品+洗脱液之间的折射率差异(dRI)。它是一种“通用”检测器（与UV检测器（示例）不同），任何与洗脱液相比折射率有显著差异的聚合物都会产生响应。在某些情况下，样品和洗脱液（例如硅胶和THF）的dRI非常小，导致信号不佳。在这种情况下，需要找到另一种能够溶解聚合物并可提供显著dRI的洗脱液。Waters 2414示差折光检测器（以及之前的2410和410型号）多年来一直是行业标杆产品。

UV检测器是GPC常用的另一种检测器。很显然，紫外检测需要具有一些能够吸收紫外线的发色团才能获得信号。UV检测器非常适合用于检测苯乙烯类聚合物（聚苯乙烯、苯乙烯/异戊二烯、苯乙烯/丁二烯、ABS等）、环氧树脂、酚醛树脂、聚碳酸酯、聚氨酯和芳香族聚酯等。如果正在执行梯度分析（在整个运行过程中溶剂组分发生变化），则必须使用UV检测器，因为RI检测器会随着洗脱液组分的变化而持续漂移。Waters 2489 UV检测器可为紫外吸收聚合物和添加剂的GPC/HPLC分析提供出众的灵敏度、线性和全方位的出色性能。  

我们还可以使用光电二极管阵列(PDA)检测器，该检测器与UV检测器相比功能有所提升，是一款功能强大，包含丰富信息的检测器。该检测器使用光电二极管阵列，能够即时观察到多种波长。例如，可以将PDA设置为检测190~800纳米(nm)的波长范围，而不是像大多数UV检测器那样只能检测一两个波长。现在我们可以查看聚合物样品（或添加剂）的实际UV谱图，以便确定一些关于化学组分分布的信息。例如，我们可以确定SBR（苯乙烯/丁二烯橡胶）是嵌段共聚物还是无规共聚物。我们可以创建光谱库，将未知样品与该光谱库进行比对。此功能可以用于聚合物或聚合物添加剂。现在我们可以尝试鉴别复合成品材料中存在哪些添加剂。PDA也可用于帮助解析竞争化合物。  

聚合物表征分析人员希望尽可能多地了解样品信息，因此还可以考虑其他检测选项。随着GPC分析进入“先进”检测领域，我们开始考虑使用分子量敏感型检测器，例如粘度计和光散射检测器。粘度计检测器将在后面的校正章节中详细讨论。实质上，将粘度计检测器与示差折光检测器相结合，我们不仅可以获得聚合物的特性粘度[h]，还可以获得“绝对”分子量和长链分支的估算值。RI检测器是浓度检测器(C)，而粘度计则为我们提供[h](C)。将这两种信号结合使用，可以获得聚合物洗脱曲线中各个切片的特性粘度，然后，我们可以使用Benoit引入的“普适校正”概念（下一节中讨论）来获得聚合物样品的绝对分子量。  

将光散射检测器与示差折光检测器联用，是GPC分析的另一种强大、先进的检测模式。本质就是将激光束聚焦到包含样品溶液的流通池中（在本例中为在线流通池）。入射光束将被溶液中的聚合物颗粒散射。基于光散射检测器的设计（小角度或多角度），无论是否使用溶液中聚合物的回转半径结果，均可准确测量重均分子量(Mw)。  

在粘度计和光散射检测器与RI联用的这两种情况下，我们获得了很多非常有用的信息。只要用户能够解析所有数据，三重检测器方法就可以提供非常有意义的数据。有关多检测器数据简化的详细讨论，请参阅我们的参考资料部分。  

还有其他先进的聚合物和添加剂检测技术，例如质谱，但当前用于GPC分析的常用检测器是RI、UV/PDA、粘度计和光散射检测器。

数据处理

配置好系统的主要硬件部分后，就必须考虑控制该系统和处理数据的软件选项。现在，功能强大的计算机可在数秒内完成校正和分子量分布计算。Empower软件可进行常规GPC（仅RI）的数据简化和RI/粘度检测。Empower 2软件支持多种校正步骤，包括相对校正、累积匹配、Hamielec宽分布标准样校正和普适校正，且能够支持零至五阶曲线拟合以及独特的有界校正和样条拟合。