体积排阻色谱初学者指南

为了给洗脱聚合物的各个保留时间切片分配分子量，我们必须对系统（或更具体而言，色谱柱组）进行校正。校正有几种方法，但最简单的方法是使用基于一组得到充分表征、且分子量分布尽可能窄的聚合物标准样进行相对校正。理想情况下，我们希望使用一组单分散标准样，即具有单一分子量，重均分子量与数均分子量的比值（分散性）等于1 (Mw/Mn = 1)。

最接近这种情况的方法是使用专门为此目的而聚合的聚合物标准样，例如阴离子聚合聚苯乙烯窄分布标准样。标准样涵盖的分子量范围很宽，从单体到分子量 > 10,000,000的聚合物皆有，且分散性 < 1.10。对于真正被认为是窄分布且可用于GPC校正的校正标准样，其分散性应 < 1.10。还有一些其他方法可进行宽分布标准样校正，并且也可以使用Benoit普适校正步骤（使用或不使用在线粘度计）。我们将详细讨论每种方法：

窄分布标准样相对校正

我们将传统的窄分布标准样校正技术称为相对校正，因为获得的是相对于校正品的平均分子量。例如，如果将聚乙烯作为样品来运行，并用聚苯乙烯窄分布标准样校正色谱柱组，则积分后获得的分子量将基于聚苯乙烯（而非聚乙烯）。但是，对于许多简单比较获得的未知样分子量和一组“接受”值的分析人员，这种方法足以满足要求。这些分子量值对于他们感兴趣的聚合物而言是否真的“绝对”并不重要；只要获得的这些值在允许的范围内即可。

有机GPC可以使用一些其他窄分布标准样，例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚异戊二烯、聚丁二烯、聚四氢呋喃，但聚苯乙烯无疑是用于有机GPC分析主要的窄分布标准样。就水性GPC而言，最常使用的是聚环氧乙烷以及低分子量聚乙二醇和支链淀粉（基于丙糖结构的多糖）。运行一系列窄分布标准样后，执行多项式拟合（通常是三阶或五阶），并绘制所得log M对保留时间（或体积）的校正曲线。

宽分布标准样校正

也可以使用宽分布标准样来校正GPC色谱柱组，该宽分布标准样与未知样是相同的聚合物。宽分布标准样可购自各种不同的供应商，并且标准样应得到充分表征，即已经通过替代方法（例如膜渗透压法、光散射法、超速离心法）确定了数均分子量、重均分子量、Z均分子量和可能的粘均分子量。另一种方法是使用（大量）物质的实际“样品”，其中平均分子量已使用这些技术确定。这种方法的优势在于能够使用与日常分析的未知样品结构相同的聚合物。

将已知的平均分子量输入软件，在未知物色谱分析所用的相同条件下，以常规方式对宽分布标准样进行色谱分析。软件将执行单纯形搜索例程，按照给定的平均分子量来拟合色谱分析得到的宽分布标准样形状。所得校正曲线将包含各平均分子量的数据点。如果仅提供数均分子量和重均分子量，则所得校正曲线将包含这两个点及峰分子量，或称为三点校正曲线。该宽分布标准样基于Hamielec在1969年所做的研究。建议使用分子量不同的两种宽分布标准样，以增加校正曲线的分子量范围。即使用带有两个已知平均分子量的两个宽分布标准样，也只能获得六点校正曲线（使用来自搜索例程结果的峰分子量值）。但是，对于每天都运行相同聚合物的QC实验室而言，在与宽分布标准样相同的分子量范围中，这种校正的效果非常出色，并可提供绝对分子量。

有机GPC可以使用一些其他窄分布标准样，例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚异戊二烯、聚丁二烯、聚四氢呋喃，但聚苯乙烯无疑是用于有机GPC分析主要的窄分布标准样。就水性GPC而言，最常使用的是聚环氧乙烷以及低分子量聚乙二醇和支链淀粉（基于丙糖结构的多糖）。运行一系列窄分布标准样后，执行多项式拟合（通常是三阶或五阶），并绘制所得log M对保留时间（或体积）的校正曲线。

普适校正

普适校正的概念由Benoit等人于1967年提出。校正中不绘制一系列窄分布标准样的分子量对数相对于保留时间的曲线，而是特性粘度[η]和分子量M乘积的对数相对于保留时间的曲线。[η]M的乘积与流体力学体积相关。Benoit发现绘制多种窄分布标准样的一系列流体力学体积值可以得到单一校正曲线。换言之，所有的点拟合相同的曲线。建立该“普适”校正之后，任何无规卷曲聚合物均可在适当的溶剂中运行，分子量依据通用曲线确定。Benoit使用玻璃毛细管粘度计来测量窄分布标准样和样品的粘度。建立通用曲线后，也可以绘制特性粘度对数相对于窄分布标准样分子量对数的曲线。此图称为粘度法则图或Mark-Houwink图。图中的斜率为alpha（有时称为α），截距称为log K。所得方程称为Mark-Houwink方程，如下所示：

Polymer Handbook（《聚合物手册》）中包含多种不同聚合物/溶剂组合的K和alpha值。可将这些经验常数输入到现在常用的许多商用GPC软件包中，获取多种聚合物的“绝对”或准确分子量。请务必确保该手册中的值对于要分析的聚合物是准确的；否则会发生错误。 

如今，我们可以将在线粘度计检测器与示差折光(dRI)检测器联用，直接获得每个切片的分子量。dRI是浓度(C)检测器，粘度计检测器可提供特性粘度与浓度的乘积([η]C)。将粘度计信号除以dRI信号，即可得到聚合物峰上每个切片的特性粘度[n i]。现在，我们已知每个切片的特性粘度，当然，还有保留时间（或体积），可回到普适校正曲线并获得每个切片的分子量(Mi)。这种“普适校正”概念具有广泛的适用性，尤其适用于无规卷曲聚合物，它代表了当前分析的大多数聚合物。其他聚合物构象，例如棒状、球体或球状（例如蛋白质）可能不符合普适概念。普适校正有效的前提是，聚合物与洗脱液或色谱柱填料之间不发生相互作用。  

使用普适校正与在线粘度计/dRI检测的另一个优势是，能够确定聚合物相对于已知线性聚合物标准样的支化程度。该技术对长链支化（相对于短链支化）非常灵敏，且对于帮助预测某种聚合物的加工方式，或其最终物理性质如何（与线性对应物相比）至关重要。 

例如，可以运行线性聚乙烯宽分布聚合物（例如“NBS 1475”，或任何其他已知的线性聚乙烯），所得Mark-Houwink值由实验确定。获得的Mark-Houwink图（或粘度法则图）将呈线性，具有恒定的斜率（alpha在整个分子量分布中保持恒定）。然后可以将K和alpha值输入到软件中，然后即可继续分析任何未知聚乙烯，并将粘度法则图与已知线性聚乙烯图进行比较。

如果未知物表现出任何长链分支，则粘度/分子量关系将不呈线性；即粘度不会随分子量线性增加。与线性的偏差越大，表明长链支化的水平越高。只有在没有长链支化，且斜率恒定的低分子量条件下，才能获得支链聚合物的准确alpha。一旦聚合物的分子量达到长链支化的程度，alpha将不断变化（甚至可能接近零）且无意义。支化聚合物与线性聚合物的粘度法则图的简单比率提供了支化指数(g')，其中：g' = [η ]br/[η]lin，可进一步计算确定支化频率、存在的支链类型等参数。很明显，在线添加粘度计检测器和示差折光检测器可以提供有关聚合物的更多信息，特别是能够：

• 通过普适校正测定聚合物的“绝对”分子量或准确分子量
• 计算聚合物的特性粘度
• 确定支化

执行GPC分析

准备GPC分析最重要的一点是找到合适的溶剂来溶解聚合物。这听起来微不足道，但请记住，GPC是一种基于溶液中聚合物大小的分离技术。聚合物链将在溶液中展开形成松弛的构象，而所选择的溶剂将决定该构象的大小。许多聚合物在室温下可溶于各种溶剂，但在某些情况下（尤其是对于高度结晶的聚合物），聚合物需要在高温下才能溶解。GPC样品制备的另一个重要方面是选择的浓度。如果色谱柱组上样品的上样量过高，则可能会产生浓度或粘度效应，导致洗脱体积不正确。是否过滤聚合物溶液是另一个需要考虑的因素。我们将讨论一些样品制备的注意事项。

请注意，在许多显示硝酸钠的情况下，许多分析人员使用了乙酸盐、硫酸盐、氯化钠等。我们建议使用硝酸钠，它已被证明可以非常一致地减少中性和阴离子化合物的离子干扰。使用这些不同洗脱液的原因是填料整体带阴离子电荷。用于水性GPC的甲基丙烯酸酯凝胶填料整体带阴离子电荷，如果单独在水中运行，可能会导致阴离子样品产生离子排斥以及阳离子样品产生离子吸附。 

洗脱液请务必在真空条件下进行过滤后再用于色谱系统。对于有机溶剂，通常使用氟碳过滤器。过滤器膜孔尺寸通常为0.45 μm（微米）。对于水性GPC（过滤水），使用乙酸盐型膜过滤器。如果准备进行光散射分析，最好通过0.20 μm过滤器过滤洗脱液。一些有机溶剂（例如DMF）非常粘稠，不能很好地润湿氟碳过滤器的表面。建议先用甲醇润湿过滤器表面，然后快速开始DMF过滤，再弃去这一少量的甲醇/DMF混合溶液，在过滤器变干之前开始DMF过滤。

浓度

为分析选择合适的溶剂后，下一步就是制备窄分布标准样和样品溶液。需要注意的是，使用足够高的浓度才能获得可接受的信噪比，但应注意避免色谱柱过载和浓度效应的风险。下表展示了制备浓度的一般经验，可作为指南使用。这些浓度以百分比表示，1.0 mg/mL表示为0.10%。参数未经温度校正，因此假定所有制备均在室温下完成。请记住，如果正在执行粘度测定或光散射分析，则需要确定进样的精确质量。如果分析在高温下进行，则需要进行密度校正。表中显示的浓度应在假定每根色谱柱的最大进样体积为100 μL的情况下使用。 

制备样品

在成功将标准样和样品溶解于选择的溶剂中并安装GPC色谱柱之后，即可开始进样。接下来要做的选择是，是否应该过滤样品溶液。在几乎所有情况下，都应该在进样前过滤样品溶液。  

一般而言，与前文讨论的溶剂过滤条件一样，选择0.45 μm膜式氟碳过滤器。在某些情况下，如果颗粒材料非常细（例如炭黑、二氧化钛、二氧化硅或其他填料），可以使用0.20 μm过滤器。  

显然，当开始使用非常细的过滤器尺寸时，聚合物剪切可能会成为一个问题。通过0.20 μm过滤器过滤高分子量聚合物肯定会导致一定程度的剪切降解。分析人员可能被迫选择完全不过滤样品，寄希望于系统压力不会因在线过滤器或色谱柱筛板堵塞而升高。  显然，当开始使用非常细的过滤器尺寸时，聚合物剪切可能会成为一个问题。

现在可以开始标准样和样品进样。如前文所述，在表中所示的浓度下，每根色谱柱的最大进样体积为100 μL。在1.0 mL/min的流速下，每根色谱柱的运行时间约为15 min，因此三色谱柱组的分析时间约为45 min。  显然，当开始使用非常细的过滤器尺寸时，聚合物剪切可能会成为一个问题。

样品组运行完成后，就可以利用数据处理系统，根据指定的积分方法处理结果并提供完整报告。数据处理可以在Empower软件的“运行并报告”模式下自动完成，也可以选择进入每个原始数据文件，然后对各个样品进行手动积分。