Guide complet pour l’hydrolyse et l’analyse des acides aminés

Comme indiqué précédemment, il existe divers équipements spécialement conçus pour vous aider à hydrolyser des échantillons. Quel que soit l’instrument utilisé, il existe généralement trois protocoles différents d’hydrolyse : l’hydrolyse acide, pour déterminer la composition en protéines totales ; l’hydrolyse acide suivant une oxydation par l’acide performique, pour mesurer les acides aminés soufrés tels que la cystéine et la méthionine ; et l’hydrolyse basique, pour évaluer le rendement en tryptophane. Alors que les équipements d’hydrolyse traditionnels impliquent souvent un processus long, les instruments d’hydrolyse par micro-ondes peuvent considérablement accélérer la réaction. Pour les trois protocoles cités, l’utilisation de l’hydrolyse par micro-ondes offre une meilleure maîtrise des conditions d’hydrolyse pour plus d’exactitude, de reproductibilité, de rapidité et de robustesse.

Grâce aux micro-ondes, le synthétiseur par micro-ondes Discover SP de CEM (CEM Corporation 3100 Smith Farm Road, NC 28104) (Figure 7) peut hydrolyser les protéines et les peptides en seulement 15 minutes en vue de l’analyse des acides aminés. Comme le montre la figure 8, l’application directe d’une énergie micro-onde et l’utilisation de capteurs de température à infrarouge intégrés permettent de chauffer rapidement les échantillons et de les maintenir à la température de consigne. L’agitation in situ assure une répartition homogène de la chaleur dans l’échantillon, et la trempe post-réaction permet de refroidir l’échantillon en quelques secondes.

La section suivante décrit comment configurer et utiliser le système. Pour plus d’informations, contactez CEM Corporation ou consultez le manuel du système.

• Le système doit être utilisé à 110-140 Vca, 60 Hz, 10 A à 120 Vca.
• Le système a besoin d’une aération.
• Le système nécessite une alimentation en air comprimé ou en azote comprimé d’une pression comprise entre 25 et 60 psi.
• Le système nécessite un ordinateur portable (fourni par CEM) situé à moins de 3 m du système.

• HCl 6 N pour l’hydrolyse acide, solution concentrée HCl-eau déionisée 1:1.
• NaOH 4 N pour l’hydrolyse basique (dissoudre 16 g de NaOH solide dans 100 mL d’eau déionisée).
• Acide performique (préoxydation uniquement), mélange 9:1 d’acide formique et de peroxyde d’hydrogène à 30 %
• Flacon de 10 ou 35 mL pour système Discover SP avec agitateur et bouchon
• Cristaux de phénol

Option 1

1. Pesez 50 à 500 mg d’échantillon dans un flacon de 35 mL contenant un agitateur.
2. Placez les tubes à digestion dans un bain de glace pendant environ 15 minutes.
3. Après refroidissement, ajoutez 5 mL d’acide performique.
4. Recouvrez les tubes avec un bouchon en verre et agitez les échantillons à l’aide d’une plaque d’agitation magnétique à basse vitesse pendant 15 minutes.
5. Replacez les tubes à digestion dans le bain de glace et laissez les échantillons s’oxyder pendant 16 heures.
6. Retirez les bouchons de verre et ajoutez 0,84 g de métabisulfite de sodium pour décomposer l’acide performique.
7. Procédez à l’hydrolyse acide en commençant par l’étape 2 de l’option 1 de la section 5.4.2 Hydrolyse acide.

Option 2

1. Pesez 50 à 500 mg d’échantillon dans un flacon de 35 mL contenant un agitateur.
2. Ajoutez 6 mL de solution d’acide performique fraîchement préparée (mélange 9:1 d’acide formique et de peroxyde d’hydrogène à 30 %).
3. Incubez le mélange réactionnel au bain-marie à 50 °C pendant une heure.
4. Évaporez la solution d’acide performique restante jusqu’à siccité à l’aide d’un évaporateur à 50 °C.
5. Procédez à l’hydrolyse acide en commençant par l’étape 2 de l’option 1 de la section 5.4.2 Hydrolyse acide.

Option 1 : échantillon de 50 à 300 mg

1. Pesez l’échantillon dans un flacon de 35 mL contenant un agitateur.
2. Ajoutez 3 % en poids de phénol.
3. Ajoutez 5 mL de HCl 6 N.
4. Bouchez le flacon.
5. Avec Dynamic Method Control (Contrôle dynamique des méthodes), programmez une méthode avec une puissance de 300 W, une durée de maintien de 15 minutes, une température de 195 °C et une pression 300 psi. Définissez une vitesse d’agitation élevée.
6. Placez le flacon dans la cavité du système Discovery et appuyez sur la touche Start (Démarrer) pour démarrer la méthode.
7. L’échantillon doit être chauffé à 195 °C, à une pression maximale de 250 psi ±10 %.

Option 2 : échantillon de 300 à 500 mg

1. Pesez l’échantillon dans un flacon de 35 mL contenant un agitateur.
2. Ajoutez 3 % en poids de phénol.
3. Ajoutez 10 mL de HCl 6 N.
4. Bouchez le flacon.
5. Avec Dynamic Method Control (Contrôle dynamique des méthodes), programmez une méthode avec une puissance de 300 W, une durée de maintien de 15 minutes, une température de 195 °C et une pression 300 psi. Définissez une vitesse d’agitation élevée.
6. Placez le flacon dans la cavité du système Discovery et appuyez sur la touche Start (Démarrer) pour démarrer la méthode.
7. L’échantillon doit être chauffé à 195 °C, à une pression maximale de 250 psi ±10 %.

Option 1 : échantillon de 50 à 300 mg

1. Pesez l’échantillon dans un flacon de 35 mL contenant un agitateur.
2. Ajoutez 5 mL de NaOH 4 N.
3. Bouchez le flacon.
4. Avec Dynamic Method Control (Contrôle dynamique des méthodes), programmez une méthode avec une puissance de 300 W, une durée de maintien de 15 minutes, une température de 195 °C et une pression 300 psi. Définissez une vitesse d’agitation élevée.
5. Placez le flacon dans la cavité du système Discovery et appuyez sur la touche Start (Démarrer) pour démarrer la méthode.
6. L’échantillon doit être chauffé à 195 °C, à une pression maximale de 250 psi ±10 %.

Option 2 : échantillon de 300 à 500 mg

1. Pesez l’échantillon dans un flacon de 35 mL contenant un agitateur.
2. Ajoutez 10 mL de NaOH 4 N.
3. Bouchez le flacon.
4. Avec Dynamic Method Control (Contrôle dynamique des méthodes), programmez une méthode avec une puissance de 300 W, une durée de maintien de 15 minutes, une température de 195 °C et une pression 300 psi. Définissez une vitesse d’agitation élevée.
5. Placez le flacon dans la cavité du système Discovery et appuyez sur la touche Start (Démarrer) pour démarrer la méthode.
6. L’échantillon doit être chauffé à 195 °C, à une pression maximale de 250 psi ±10 %.

Les réglages de température, de durée et de puissance dépendent des types d’échantillons à hydrolyser. Il est important de laisser l’énergie micro-ondes active pendant toute la procédure. Vous pourriez devoir faire quelques expérimentations afin d’optimiser le traitement des échantillons à l’aide de cette technique.

Il est recommandé d’utiliser la taille, le volume et les récipients d’échantillon adaptés pour les procédures décrites précédemment. Ces facteurs sont essentiels au succès de l’hydrolyse. Certains composés de l’échantillon restent en phase solide après hydrolyse et noircissent généralement pendant le processus, comme le montre la figure 9. Cela est normal. Les acides aminés seront présents dans la solution. Pour toute question relative à l’utilisation de l’équipement CEM, envoyez un e-mail à molecular.support@cem.com ou appelez le 1-704-821-7015, puis demandez l’équipe de préparation des échantillons moléculaires de CEM Corporation.