Guide complet pour l’hydrolyse et l’analyse des acides aminés

Les peptides et les protéines sont constitués de nombreux acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Ces biomolécules entrent dans la composition d’une grande variété d’échantillons, tels que des produits biothérapeutiques ou destinés à l’alimentation humaine et animale. Pour analyser les acides aminés contenus dans ces biomolécules, il est essentiel d’hydrolyser les liaisons afin de former des acides aminés libres. Toutefois, au cours de ce processus, les différentes propriétés chimiques des liaisons d’acides aminés conjugués peuvent affecter à la fois l’efficacité de la coupure des liaisons d’acides aminés et le rendement de certains acides aminés. Par exemple, le rendement en acides aminés pendant l’hydrolyse peut être affecté par des réactions chimiques spécifiques, des interférences avec la matrice des réactifs et la stabilité des acides aminés eux-mêmes.

Au vu de la grande diversité des propriétés chimiques et physiques des échantillons et des acides aminés, différentes procédures d’hydrolyse ont été développées au fil du temps. Les procédures se distinguent par le type de réaction (chimique ou enzymatique), la nature de la réaction chimique (acide ou basique) et l’état physique de la réaction (liquide ou vapeur). Ces différences peuvent avoir un impact sur le rendement de certains acides aminés, qui peuvent être détruits par certains réactifs, ou sur l’efficacité et la durée de l’hydrolyse. Dans certains cas, il est nécessaire de réaliser plusieurs hydrolyses afin de déterminer la teneur totale en acides aminés d’un échantillon. Vous trouverez ci-après une description des types de réactions d’hydrolyse chimique couramment utilisés ainsi que des différents modes d’hydrolyse.

Remarque : L’hydrolyse enzymatique, procédure peu courante, n’est pas abordée dans le présent document.

Notez également que les nombreuses réactions d’hydrolyse chimique peuvent être réalisées avec différents types d’équipement. Traditionnellement, on réalisait une hydrolyse à l’aide d’une source de chaleur sous vide pour assurer l’achèvement de la réaction. Mais, l’apparition d’équipements plus innovants a popularisé l’hydrolyse induite par micro-ondes. Chaque méthode présente des avantages qui lui sont propres. Il vous revient de les étudier avant de choisir l’équipement utilisé.

1.1.1 Hydrolyse acide

L’hydrolyse acide est la méthode la plus couramment utilisée pour traiter un échantillon de protéine. Elle peut être réalisée en phase vapeur ou liquide. Bien qu’il soit possible d’utiliser différents acides pour cette réaction, on utilise généralement du HCl 6 M. Comme il est volatil, le HCl peut également être utilisé pour récupérer l’hydrolysat dans de petites quantités de tampon, ce qui est particulièrement utile pour les petits échantillons. De plus, la polyvalence du HCl lui permet d’être utilisé pour l’hydrolyse en phase liquide comme en phase vapeur.

La réaction d’hydrolyse acide avec le HCl 6 M entraîne l’ajout d’une molécule d’eau à chaque liaison peptidique covalente, ce qui permet de récupérer chacun des acides aminés souhaités (Figure 1). Toutefois, l’hydrolyse par HCl ne permet pas un rendement total pour tous les acides aminés. Certains acides aminés sont hydrolysés en leurs formes acides, comme l’asparagine et la glutamine, qui forment respectivement l’acide aspartique et l’acide glutamique. Notez également que d’autres acides aminés ne peuvent pas être mesurés de manière fiable. C’est le cas du tryptophane, qui est détruit pendant la réaction, ou des acides aminés soufrés (comme la cystéine et la méthionine), qui ne peuvent pas être mesurés de manière fiable en raison de leur destruction partielle. Par ailleurs, les acides aminés tels que la tyrosine, la sérine et la thréonine peuvent avoir un rendement plus faible en raison de la nature de l’hydrolyse acide.

Cependant, certains acides aminés soufrés (comme la cystéine et la méthionine) peuvent être conservés lors de l’hydrolyse acide par HCl si l’échantillon est soumis à un traitement préalable. Pour quantifier avec précision ces acides aminés, l’échantillon peut être oxydé ou alkylé avant l’hydrolyse acide par HCl. Dans le cas de l’oxydation, généralement avec de l’acide performique, les acides aminés soufrés sont oxydés avant l’hydrolyse acide par HCl. On peut alors quantifier avec précision ces acides aminés sous leur forme oxydée. Quant à l’alkylation, elle permet de conserver les acides aminés soufrés (cystéine) et ainsi de quantifier avec exactitude leurs formes alkylées. Deux des réactifs d’alkylation les plus couramment utilisés produisent de la cystéine sous la forme de pyridyléthylcystéine ou de carboxyméthylcystéine. Un avantage supplémentaire de l’alkylation est qu’elle n’affecte pas les autres acides aminés.

Enfin, compte tenu des difficultés que pose la quantification de certains acides aminés par hydrolyse de HCl, il existe d’autres techniques d’hydrolyse acide adaptées à des acides aminés spécifiques. L’une d’entre elles utilise des acides sulfoniques, tels que les acides méthylesulfoniques (MSA), pour quantifier le tryptophane et la méthionine sous forme de sulfoxyde. Bien que ce réactif ne soit pas volatil, il préserve le tryptophane et le sulfoxyde de méthionine pour l’analyse quantitative.

1.1.2 Hydrolyse basique

Alors que l’hydrolyse acide par HCl est de loin la technique la plus courante pour hydrolyser les protéines et les peptides, on a généralement recours à l’hydrolyse alcaline ou basique pour doser le tryptophane. Le tryptophane étant stable en milieu basique, cette technique permet de quantifier avec exactitude le tryptophane et est largement utilisée pour une variété d’échantillons, des produits alimentaires aux peptides et protéines. L’hydrolyse basique utilise généralement du NaOH ou du KOH comme réactif. Cependant, l’hydrolyse basique ne peut pas se substituer à l’hydrolyse acide pour la quantification de tous les acides aminés. En milieu basique, l’arginine, la cystéine, la sérine et la thréonine sont détruites et ne peuvent être quantifiées. D’autres acides aminés sont également affectés. L’hydrolyse basique n’est donc généralement utilisée que pour le tryptophane.

Les réactions d’hydrolyse sont réalisées en phase liquide ou en phase vapeur. Pour l’un et l’autre de ces modes, les instruments spécialement conçus pour l’hydrolyse facilitent la réaction. Traditionnellement, on réalisait de nombreuses réactions d’hydrolyse à des températures élevées et sous vide sur une période de plusieurs heures, voire plusieurs jours, mais avec l’avènement des instruments d’hydrolyse par micro-ondes, la même réaction peut être induite en quelques minutes à des températures plus basses.

1.2.1 Hydrolyse en phase liquide

Pour l’hydrolyse en phase liquide, l’échantillon et le HCl sont directement introduits dans le tube à hydrolyse, où se produit la réaction. Pour cela, il faut directement ajouter l’échantillon, l’étalon interne et l’acide dans le tube à hydrolyse. Le tube est rincé à l’azote, fermé hermétiquement et chauffé jusqu’à l’achèvement de la réaction, qui peut prendre plusieurs heures, voire plusieurs jours. Cette procédure est généralement utilisée pour des échantillons plus complexes.

1.2.2 Hydrolyse en phase vapeur

Lors d’une hydrolyse en phase vapeur, l’échantillon ne réagit qu’avec le HCl à l’état gazeux. La procédure nécessite de placer l’échantillon et l’étalon interne (le cas échéant) dans des tubes à hydrolyse. L’échantillon est ensuite séché, et chaque tube est placé ouvert dans un récipient à hydrolyse. On ajoute ensuite de l’acide (HCl 6 M) au fond du récipient contenant les tubes. Le récipient est ensuite scellé, mis sous vide et rincé à l’azote. Le récipient est chauffé pendant le temps nécessaire à l’achèvement de l’hydrolyse. Cette technique réduit le risque de contamination par des réactifs impurs, tels que le HCl. L’hydrolyse en phase vapeur est généralement plus rapide que l’hydrolyse en phase liquide. Elle nécessite généralement des échantillons de pureté élevée.