Manuel d’introduction à la SFC préparative

Circuit fluidique et matériel

Grâce aux innovations des instruments modernes de SFC préparative, de nombreux obstacles associés à la SFC préparative ont été surmontés. La figure 7 illustre le circuit fluidique général des instruments de Prep SFC. La SFC utilise le même circuit fluidique de base que la HPLC, ce qui comprend pompage binaire et contrôle des méthodes, introduction de l’échantillon dans le circuit fluidique à l'aide d'injections, séparations par des colonnes, détection des pics et collecte des fractions. Dans le cas de la SFC, des technologies supplémentaires sont nécessaires, principalement pour gérer la compressibilité et l'expansion du CO₂. Cela inclut les échangeurs de chaleur (HE), les régulateurs de contre-pression (BPR), les séparateurs gaz-liquide (GLS) et l’utilisation presque universelle de tubulures en acier inoxydable haute pression.

Considérations pour chaque composant

Pompage : dans la SFC, comme dans la LC, les systèmes de pompage binaire délivrent un solvant « A », (toujours du CO₂ dans ce cas), et un solvant « B », (généralement un solvant organique polaire comme le méthanol). En fonction de l’échelle du système, le CO₂ est délivré de deux manières : soit en volume (débit volumique), ce qui est typique à l’échelle analytique, soit de façon massique (débit massique), comme c’est souvent le cas à l’échelle préparative. Le CO₂ étant compressible, des volumes identiques ne correspondent pas nécessairement à une masse identique en raison des différences de densité. Les deux méthodes de distribution sont utiles à condition que les débits soient reproductibles, indépendamment des conditions environnementales. Dans la plupart des cas, le CO₂ est refroidi avant la pompe ou dans les têtes de pompe, puis est pompé sous forme liquide pour réduire les éventuels écarts de densité de la phase mobile. De plus, tous les joints, valves anti-retour, tubulures et raccords doivent être capables de traiter un fluide compressible haute pression sans fuir. Puisque le CO₂ se détend facilement à travers n’importe quelle ouverture, une fuite, même minime, peut avoir un impact important sur les performances du système et sur la chromatographie. Un mauvais pompage du CO₂, que ce soit en raison de fuites des tubulures, des joints ou des valves anti-retour, peut entraîner non seulement des modifications du temps de rétention et de la sélectivité, mais également un mauvais contrôle de la pression (densité) et un bruit de la ligne de base.

Injections : il existe deux modes d’injection couramment pratiqués : l’injection de flux mixte et l’injection de flux de modificateur. Ils seront détaillés dans la section « Stratégies d’injection en SFC ». Les schémas d’injection de SFC à flux mixte impliquent une étape de dépressurisation afin de purger le CO₂ de la boucle d'injection avant le chargement de l’échantillon. Par mesure de sécurité, la dépressurisation peut également être pratiquée dans les systèmes qui effectuent des injections de flux mixte et de flux de modificateur. Cette opération est généralement effectuée à l'aide d'une vanne de « purge » secondaire. L’un des inconvénients de cette configuration est le volume extra-colonne ajouté au système pendant l’injection, qui peut entraîner un élargissement des pics et une perte de résolution. En maintenant le volume au minimum à l’aide d’une tubulure de petit diamètre intérieur, l’élargissement des pics est réduit.

Four à colonnes et chauffage : en SFC, la pression et la température sont des paramètres de méthode qui influent sur la séparation, car ils affectent la densité de la phase mobile. Par conséquent, le chauffage et le contrôle de la température de la phase mobile et de la colonne doivent être appropriés. Si la température n’est pas correctement contrôlée, les gradients de température qui se produisent dans la colonne peuvent avoir des effets négatifs sur la forme des pics et la résolution. Dans de nombreux systèmes de SFC, cela se fait soit en chauffant la colonne dans un four, soit en préchauffant la phase mobile, soit en faisaint les deux.

L’identification de la bonne chimie de colonne (chirale et achirale) est essentielle en SFC. La sélection des colonnes est donc nécessaire dans les applications de SFC. De nombreux systèmes de SFC sont équipés d’un certain type de vanne de commutation inclus dans le four pour choisir entre plusieurs colonnes. Ceci est particulièrement important dans les applications où les échantillons et les cibles purifiés sont nombreux et variés, impliquant probablement des chimies de colonne différentes.

Détecteurs : toutes les techniques de détection typiques utilisées en purification, telles que UV/Vis, PDA, MS et ELS, sont compatibles avec la SFC, et plusieurs détecteurs peuvent être utilisés au sein d’un même système. En général, les détecteurs UV/Vis et PDA sont raccordés au circuit fluidique principal, car ce sont des détecteurs non destructifs utilisés pour la détection primaire. Les cellules de détection de ces détecteurs doivent correspondre aux pressions utilisées dans la SFC. Les détecteurs destructifs, tels que le MS et l’ ELS, sont raccordés à l’aide d’une technologie de division qui a un contrôle relatif du rapport de divison et conditionne le solvant pour optimiser le signal de détection. Plusieurs signaux (ou canaux) du détecteur peuvent être consignés ou utilisés pour le déclenchement de la collecte des fractions, étendant ainsi le champ d’application de la technologie pour la SFC analytique et préparative. L’utilisation de ces détecteurs en SFC est décrite plus en détail dans la section « Détection optique et par MS en SFC » de ce chapitre.

Régulateur de contre-pression (BPR) : le contrôle de la densité de la phase mobile le long de la colonne est l’un des facteurs les plus importants de la conception des instruments de SFC, car la solubilité et le facteur de rétention de tous les composés sont étroitement liés à la densité du fluide. Le contrôle de la densité s’effectue principalement en contrôlant la pression dans le système. Le régulateur de contre-pression est un dispositif automatisé conçu pour réguler la pression post-colonne (contre-pression) du système à une pression spécifiée dans la méthode. Pour acquérir une chromatographie reproductible adaptée, la pression post-colonne doit rester constante (au point de consigne), même dans les conditions du gradient et d'une analyse à l'autre. 

Même si le CO₂ est considéré comme supercritique au-dessus de 74 bar (~1073 psi) et de 31 °C, l'analyse n’est généralement pas recommandée dans des conditions proches du point critique, car de faibles variations de température ou de pression dans cette région entraînent des variations importantes de densité. En conséquence, les méthodes développées dans cette région seraient moins robustes en matière de rétention et de résolution. De plus, lorsque des cosolvants sont utilisés, une séparation de phase est plus probable dans des conditions de basse pression, entraînant un bruit de ligne de base. Par conséquent, la plupart des méthodes de SFC utilisent des points de consigne de pression plus élevés, généralement supérieurs à 100 bar (1450 psi).

Déclencheurs de collecte : en Prep SFC, les collectes peuvent être déclenchées sur plusieurs canaux et détecteurs en utilisant les modes de collecte en fonction du seuil, du temps et de la pente (définis dans le tableau 3). La logique booléenne est utilisée pour une collecte plus intelligente et requiert que plusieurs conditions soient remplies avant que la collecte ne se produise. Les conditions de collecte peuvent inclure des combinaisons de modes, comme le seuil et le temps, ou des combinaisons de signaux du détecteur, comme un seuil UV et une confirmation en masse.

Tableau 3. Définitions des modes de collecte utilisés en SFC préparative.

Le délai de programmation de collecte est également important et des délais adéquats entre le détecteur et le système de collecte doivent être déterminés pour une récupération optimale des composés cibles. Comme en Prep HPLC, ces délais dépendent des débits. Cependant, dans le cas de la SFC, des changements dans la programmation de la collecte s'accompagnent également de changements dans la composition et la pression de la phase mobile. Grâce à des solvants d’appoint, et à d’autres technologies atténuant l'expansion du CO₂, la programmation peut être mieux contrôlée dans certaines conditions à un débit défini.

Stratégies d’injection en SFC

Il existe actuellement deux approches pour l’injection d’échantillons dans les applications de SFC : l’injection de flux mixte et l’injection de flux de modificateur. En injection de flux mixte, la totalité de la phase mobile (le CO₂ et le cosolvant) balaye la boucle et transporte l’échantillon jusqu’à la colonne. Les problèmes courants liés à l’injection de flux mixte sont la distorsion des pics et les décalages des temps de rétention dus à de forts effets de diluant. La pratique standard consiste à dissoudre l’échantillon dans le modificateur polaire (cosolvant). L'utilisation d'un solvant fort tel que le méthanol empêche l'absorption d'une partie de l'analyte en phase stationnaire, ce qui entraîne une rupture ou une distortion des pics. Pour les pics moins retenus, l’impact est plus important et la distorsion s’accentue. Lorsque le volume d'injection augmente, le slug du solvant polaire provoque des perturbations localisées dans la phase mobile, déformant encore plus les pics tout en diminuant la résolution. Cette stratégie d'injection nécessite également une dépressurisation, ce qui peut avoir un impact sur le chargement de l'injection et la répétabilité. Avec l’injection en flux mixte, il a été démontré que les diluants de polarité similaire à celle du CO₂ (comme l’hexane, l’heptane ou d’autres solvants non polaires) amélioraient la forme des pics (Figure 8).

La deuxième stratégie d’injection est l’injection de flux de modificateur, dans laquelle l’échantillon est injecté dans la partie organique de la phase mobile (cosolvant) avant d’être mélangé avec du CO₂. Cette méthode est similaire aux schémas de dilution en colonne utilisés dans la purification LC. L'objectif est d'atténuer l'effet du diluant en introduisant l'échantillon sans affecter la force globale de la phase mobile, et en maintenant les pourcentages de solvant programmés tout au long de l'injection et de l'analyse. Dans ce cas, le diluant doit correspondre au cosolvant utilisé pour la séparation, bien que d'autres diluants peuvent être utilisés. L’injection du flux de modificateur améliore la forme et la résolution des pics, ce qui permet d’obtenir des volumes d’injection et un chargement plus importants (Figure 9).

Lors de l’utilisation d’une injection de flux de modificateur à faibles pourcentages de cosolvant, le temps d’application de l’échantillon en tête de colonne augmente en raison du faible débit de la pompe de cosolvant. En raison de la phase mobile hautement diffusive, il est possible que l’augmentation du temps d’injection produise des pics plus larges par rapport aux injections de flux mixte. Cependant, la forme des pics reste améliorée par rapport à des injections de flux mixte de volume élevé à de faibles pourcentages de cosolvant. Même si le flux mixte transfère l’échantillon à la colonne plus rapidement, l’ampleur de la perturbation dans ces conditions prévaut sur tout avantage. À mesure que le pourcentage de cosolvant augmente, le choix de la technique d'injection devient moins critique, mais à de faibles pourcentages de cosolvant, le flux de modificateur est significativement meilleur.

Détection PDA et UV/Vis

Il existe des considérations spécifiques à la SFC dans le cas de la détection optique en SFC. Les variations de densité de la phase mobile et les différences d’indices de réfraction entre le CO₂ et le cosolvant créent une dérive et un bruit sur la ligne de base dans les détecteurs UV/Vis et PDA. Ces effets sont particulièrement prononcés dans des conditions de gradient. Dans les détecteurs PDA, la ligne de base peut être ajustée à l’aide de canaux de longueur d’onde unique et d’une compensation de longueur d’onde qui réduit le bruit de la ligne de base et augmente la sensibilité (Figure 10). Pour les détecteurs UV/Vis, le réglage d'une seule longueur d'onde diminue le bruit et la dérive de la ligne de base.

Du point de vue matériel, des cellules de détection spécifiques ont été conçues pour supporter les pressions élevées des applications de la SFC et peuvent être utilisées dans les détecteurs 2998 PDA et 2489 UV/Vis de Waters. Les propriétés de conception de la cellule de détection, notamment la longueur du trajet optique, la géométrie et le matériau de la cellule, ont été étudiées pour optimiser la détection dans les applications de la SFC.

Détection MS

L’un des grands avantages de la SFC est de pouvoir associer la sélectivité de la phase normale à la compatibilité MS. Le CO₂ en SFC non seulement remplace les solvants non compatibles tels que les hexanes et les heptanes, mais contribue également, par le biais de la dilatation du gaz, à la nébulisation et à la formation de particules dans la source du spectromètre de masse. Le système SFC est compatible avec les modes ESI, APCI et l'acquisition bi-mode, et ce dans une large gamme d’instruments MS. Le détecteur ACQUITY QDa de Waters est particulièrement utile en Prep SFC, car il est facile à utiliser. Cependant, à de faibles pourcentages de cosolvant, il n'y a souvent pas assez d'ions présents pour une détection optimale du signal. Pour cette raison, un solvant de conditionnement (ou d'appoint) est généralement ajouté à la séparation pour amplifier le signal du spectromètre de masse. Un solvant de conditionnement typique contient un mélange de méthanol, d'eau et un additif (souvent de l'hydroxyde d'ammonium ou de l'acide formique). De nombreux autres mélanges de solvants de conditionnement sont utilisés, à différents débits, en fonction des préférences de l'utilisateur, du type d'instrument MS et de l'échelle de l'application. Des exemples de détection MS-ESI sur un détecteur ACQUITY QDa de Waters avec et sans solvant de conditionnement sont présentés en Figure 11.

Détection ELS

La SFC est également compatible avec la détection ELS. Comme pour la spectrométrie de masse, une séparation est utilisée et un solvant d'appoint est ajouté pour améliorer le signal. La phase mobile de la SFC étant très volatile, le solvant supplémentaire est nécessaire pour transporter l'échantillon et obtenir un meilleur signal dans le détecteur ELS. Sur le plan opérationnel, l’ELSD est piloté de manière similaire pour la SFC et la LC.

Collecte en Prep SFC : considérations relatives à l'expansion du CO₂

Les propriétés d’une phase mobile en expansion sont importantes pour le contrôle de la collecte en Prep SFC. Au point critique, soit 31 °C et 74 bar, l'expansion volumique du CO₂ pur par rapportà des conditions atmosphériques (1 bar et 15 °C) est environ 250 fois supérieure.

Dans les systèmes préparatifs SFC, le CO₂ à haute pression sort au niveau du régulateur de contre-pression (BPR). Cette expansion volumique augmente de façon exponentielle à mesure que la pression du CO₂ sortant augmente. Dans les systèmes binaires, comme la phase mobile de la SFC typique, l'expansion diminue à mesure que la fraction de CO₂ diminue et que la partie organique augmente. Au fur et à mesure de l'expansion, la capacité de dissolution de la phase mobile est réduite, à la fois par le manque de pouvoir de solvatation et par le refroidissement par l'effet Joule-Thomson. Le refroidissement peut également entraîner la formation de neige carbonique susceptible de boucher la tubulure. Un contrôle insuffisant de l'expansion peut entraîner une distorsion des pics dans le circuit fluidique de collecte, réduisant ainsi la pureté de la fraction. Il peut également en résulter une perte de rendement, car les composés cibles sont entraînés vers les déchets ou sont perdus par vaporisation au point de collecte.

Pour collecter correctement les fractions, de nombreuses stratégies sont utilisées dans les instruments de SFC pour contrôler l'expansion du CO₂ et ses effets. Tout d'abord, afin d'atténuer le refroidissement et les problèmes qui lui sont associés, la phase mobile est chauffée au point d'expansion initial, juste en aval du régulateur de contre-pression. Ensuite, dans de nombreux cas, un solvant d’appoint organique est ajouté, ce qui non seulement maintient les composés en solution, mais aide également à contrôler l'expansion en abaissant la fraction volumique de CO₂. Un meilleur contrôle de l'expansion permet d’améliorer la forme des pics post-BPR et le rendement. Enfin, le CO₂ est purgé ou éliminé. En général, un certain type de dispositif de séparation de phase est utilisé à cette fin, comme des séparateurs haute pression de type cyclone ou gaz-liquide (GLS) (Figure 12).

Les séparateurs cycloniques haute pression poussent la partie la plus lourde (liquide) de la phase mobile vers l'extérieur et le bas du cyclone, tout en permettant au gaz (CO₂) de s'échapper par le centre et le haut. L’avantage des séparateurs cycloniques haute pression est qu’ils ne requièrent pas de solvant d'appoint (même à des pourcentages de cosolvant plus faibles), car le pouvoir de solvatation du CO₂ est maintenu à travers la vanne de collecte et la séparation des phases se produit dans les séparateurs cycloniques. Toutefois, il existe également plusieurs inconvénients. Les systèmes de collecte à haute pression requièrent l’utilisation de matériaux à haute pression, comme l’acier inoxydable, et représentent un risque accru pour la sécurité en raison de la nébulisation et de l'expansion associées à la récupération des fractions. Ces systèmes restreignent également l’utilisateur à un nombre limité de positions disponibles pour la collecte en mode lit fermé. Le séparateur gaz-liquide (GLS) est une option à basse pression qui présente de nombreux avantages. Les systèmes basse pression permettent l’utilisation de matériaux conçus pour des pressions moindres et réduisent considérablement les risques concernant la sécurité. De plus, bien que la collecte nécessite généralement plus de solvant, l’élimination plus complète du CO₂ dans des conditions à basse pression rend possible la collecte à lit ouvert, ce qui augmente considérablement le nombre de fractions pouvant être collectées et étend les possibilités d’application de la technologie.

Sélectivités et applicabilités variées

La Prep SFC augmente considérablement la sélectivité du processus de purification. Alors que la SFC utilise généralement une séparation en phase normale, cette technique est incroyablement flexible car elle permet l’utilisation de certaines colonnes RPLC classiques et de certains solvants, ce qui étend la plage de compatibilité des composés. La possibilité de couvrir cette large plage de sélectivité constitue un avantage certain pour la SFC, car elle permet une séparation orthogonale au sein d'une même plateforme, simplifiant ainsi l'ensemble du processus de purification.

Compatibilité de la SFC : solubilité

La SFC fonctionne, en général, selon un mode de séparation chromatographique en phase normale. Dans des conditions de fonctionnement typiques, la majorité de la phase mobile est constituée de CO₂ non polaire associé à une faible fraction de solvant organique polaire. La séparation a lieu sur des colonnes garnies de petites particules contenant des phases stationnaires relativement polaires aux fonctionnalités étendues. En raison de la faible viscosité de la phase mobile et des colonnes à petites particules, la SFC est principalement utilisée pour des applications à petites molécules. Cependant, la gamme d’applications de masses moléculaires plus élevées réalisées à l’aide de la SFC s’étend continuellement. Dans le cas contraire, l'éligibilité d’un composé pour la SFC dépend principalement de sa solubilité. La SFC présente une plage de solubilité extrêmement large. En effet, en règle générale, tout échantillon pouvant être dissout dans un solvant organique est un candidat pour la SFC. Ceci est très utile, car de nombreuses techniques de préparation d'échantillons entraînent la dissolution des échantillons dans des solvants organiques, qui peuvent être directement injectés dans les instruments de Prep SFC.

Une information utile concernant la solubilité d’un composé dans les solvants organiques concerne le coefficient de partage, généralement appelé LogP. En général, le LogP est une mesure du caractère lipophile ou hydrophobe d'un composé. Plus précisément, il s'agit du rapport de concentration d'un composé dans les deux phases d'un mélange de deux solvants non miscibles en équilibre; généralement de l’eau et de l’octan-1-ol. Le CO₂ étant un solvant non polaire, les valeurs de LogP constituent un bon indicateur du comportement d'un composé dans des conditions de SFC. Des LogP faibles indiquent une polarité plus élevée, ce qui entraîne une solubilité moindre dans le CO₂ et une plus grande affinité pour les chimies de la colonne polaire, tandis que des LogP élevés indiquent une faible polarité, entraînant une solubilité accrue dans le CO₂ et une affinité moindre pour la colonne. L'inverse est vrai en RPLC, où la phase mobile est polaire et la phase stationnaire est non polaire.

Dans les applications analytiques (UPC²), des échantillons moins chargés et moins concentrés peuvent accueillir des composés dont les valeurs de LogP sont comprises entre -2 et 9. Dans le cas de la SFC préparative, il est toutefois important que les composés restent en solution lorsqu'ils sont introduits dans le CO₂ dans des conditions de chargement élevé. La solubilité des échantillons contenant des composés très polaires ou hydrophiles à des concentrations et des quantités préparatives doit être testée avant leur injection dans le système. Pour ce faire, il faut généralement dissoudre l'échantillon dans un solvant organique adapté, puis introduire une petite quantité d'hexane ou d'heptane. Si l'échantillon précipite hors de la solution, il est généralement considéré comme non adapté à la SFC préparative.

L’un des inconvénients de la Prep SFC est la faible solubilité des composés hautement polaires. Cependant, avec l’ajout d’une petite quantité d’eau (comme additif, généralement moins de 5 % v:v) à la partie organique de la phase mobile, la SFC peut être utilisée pour une plage de polarité d’échantillon encore plus large. L'eau augmente la solubilité des composés hydrophiles, ce qui permet la séparation et la purification de ces composés. Le domaine d’application de la SFC peut donc être étendu à l’étude des peptides, des protéines, des nucléobases et d’autres analytes hydrophiles. Bien que cette technique se soit avérée utile dans les applications polaires, elle doit être utilisée avec précaution dans le cas de la SFC préparative afin d’éviter la précipitation de l’échantillon ou la formation de glace à la sortie du système.

Applicabilité de la SFC : cosolvants

La sélection des cosolvants est un paramètre clé de la SFC pour le développement et l’optimisation de méthodes chromatographiques. En chromatographie liquide en phase normale comme en phase inverse, la miscibilité des solvants est soumise à des restrictions. Les hydrocarbures aliphatiques en phase normale et l'eau en phase inverse limitent la plage de polarité des solvants pouvant être utilisés dans ces séparations. En SFC, le CO₂ supercritique est miscible avec les solvants organiques en phase inverse et en phase normale, du méthanol aux heptanes, proposant ainsi une large gamme de choix de sélectivité de solvant pour réaliser une séparation. Cette large gamme de sélectivité augmente considérablement la plage d'applications compatibles avec la SFC.

Applicabilité de la SFC : colonnes

En chromatographie en phase inverse, la plupart des séparations sont réalisées sur un nombre limité de phases stationnaires, généralement des colonnes C₁₈ ou des colonnes hydrophobes similaires. Une grande variété de chimies de colonnes chirales et achirales, couvrant à la fois la plage de phase inverse (non polaire) et la plage de phase normale (polaire), sont applicables en SFC. Les composés basiques, neutres et acides ont bien élués sur la plupart des colonnes, ce qui indique que la Prep SFC est adaptée à une large gamme de fonctionnalités chimiques. L'utilisation d'une variété de colonnes peut être considérée comme un inconvénient, mais elle permet également d'optimiser la sélectivité pour purifier un composé particulier. Les phases stationnaires de la SFC préparative moderne offrent plus de possibilités pour une utilisation accrue de la SFC pour la purification chirale et achirale. Nottament, les colonnes Viridis et Torus de Waters sont spécialement conçues pour l’application SFC, offrant une meilleure stabilité, une large plage de sélectivité et une meilleure forme de pics, réduisant ainsi les besoins en additifs. Le tableau 4 présente une liste des colonnes de Waters couvrant la plage d’applicabilité de la Prep SFC. La sélection des colonnes est un paramètre clé dans le développement et l’optimisation des méthodes.

Séparation chirale

La SFC est de loin la meilleure solution chromatographique pour la séparation des composés chiraux. Elle apporte des améliorations considérables quant à l'efficacité et à la vitesse de séparation, par rapport à d'autres techniques chromatographiques, telles que la HPLC en phase normale. Les séparations chirales sont généralement obtenues par HPLC en phase normale. En SFC, ces séparations sont réalisées en un temps significativement plus court, tout en augmentant la résolution et en réduisant la consommation de solvant.

Les colonnes chirales sont donc largement utilisées dans l’environnement de la SFC, non seulement pour les applications chirales, mais également pour la séparation de diastéréoisomères, de métabolites, de régioisomères et d’autres composés structurellement apparentés. Alors que les phases à base de cellulose et d’amylose sont les plus utilisées, d’autres phases stationnaires chirales sont également compatibles. Cela représente des avantages pour la purification de ces composés, tels que des fractions plus pures, une meilleure efficacité et des réductions de coûts grâce à une utilisation réduite des solvants. La figure 13 illustre la séparation chirale des énantiomères et des diastéréoisomères de la perméthrine par HPLC en phase normale et par SFC.

Les quatre pics n'ont pas pu être résolus par HPLC; cependant, ils ont été résolus en moins de temps et en utilisant une colonne plus courte avec la technique de la SFC.