Manuel d’initiation à la SPE
Un outil puissant pour une meilleure préparation des échantillons
En tant que scientifique analytique, vous êtes confronté à de nombreux défis lorsque vous devez choisir les outils à utiliser pour obtenir le résultat souhaité. Le choix des outils et des méthodes de préparation des échantillons est en effet une étape importante, susceptible d’avoir un impact significatif sur la réussite de vos analyses.
Idéalement, vous préféreriez ne pas devoir vous soucier de la préparation des échantillons. Mais, dans la réalité, cette étape est souvent nécessaire. Il se peut que vous deviez optimiser une méthode pour un échantillon existant afin d’améliorer la vitesse d’analyse ou de réduire le coût par analyse. On peut également vous demander d’analyser une grande variété de types d’échantillons différents afin d’identifier de nouveaux composés intéressants. Chaque nouveau type d’échantillon peut présenter des défis analytiques différents. De plus, les scientifiques sont aujourd’hui confrontés au défi majeur de rapporter des valeurs à des niveaux de concentration plus faibles que jamais, sans compromettre l’exactitude et la fidélité.
Ce manuel devrait vous aider à découvrir et à comprendre un outil très puissant en matière de préparation des échantillons : l’extraction en phase solide ou SPE. Vous verrez comment cette technologie, qui utilise des dispositifs avec remplissage chromatographique, peut vous aider à relever vos défis analytiques.
Définition de l’extraction en phase solide
La SPE est une technologie de préparation des échantillons qui utilise un matériau de remplissage chromatographique composé de particules solides, généralement contenu dans un dispositif de type cartouche, pour séparer chimiquement les différents composés d’un échantillon. Les échantillons sont presque toujours à l’état liquide (bien qu’il soit possible d’exécuter des applications spécialisées avec des échantillons en phase gazeuse). La figure 1 montre un échantillon, représenté en noir, traité sur un dispositif SPE de manière à séparer par chromatographie les différents composés colorants qui le constituent.
Figure 1. Exemples d’une méthode SPE.
Le lit chromatographique peut être utilisé pour séparer les différents composés d’un échantillon et ainsi améliorer la réussite des tests analytiques ultérieurs. Par exemple, la technologie SPE est souvent utilisée pour l’élimination sélective des interférences.
Le nom techniquement correct de cette technologie est « Extraction en phase liquide-solide », car les particules chromatographiques sont solides et l’échantillon est à l’état liquide. Les principes fondamentaux de la chromatographie liquide utilisés en HPLC le sont également ici, mais dans un format différent et pour une autre raison. Ici, la chromatographie est utilisée pour mieux préparer un échantillon avant de le soumettre à des analyses.
Lors de la préparation des échantillons, ceux-ci peuvent provenir de sources très diverses. Il peut s’agir de fluides biologiques comme le plasma, la salive ou l’urine ; d’échantillons environnementaux comme l’eau, l’air ou le sol ; de produits alimentaires comme les céréales, la viande et les fruits de mer ; de produits pharmaceutiques ; de nutraceutiques ; de boissons ; ou encore de produits industriels. Même une tête de moustique peut faire partie des échantillons ! Lorsqu’un scientifique avait besoin d’analyser des neuropeptides extraits du cerveau de moustiques, il utilisait de préférence la SPE pour la préparation des échantillons (Base de données des applications de Waters, 1983).
Les quatre principaux avantages de la SPE
L’utilisation de la SPE présente de nombreux avantages, mais quatre d’entre eux méritent une attention particulière.
1. Simplification d’une matrice complexe avec purification des composés
Pour un chimiste analytique, le plus difficile est de se trouver face à des composés d’intérêt contenus dans une matrice complexe, comme des mycotoxines dans des céréales, des résidus d’antibiotiques dans des crevettes ou des métabolites de médicaments dans le plasma, le sérum ou l’urine. L’analyse est en effet extrêmement difficile en raison du grand nombre de substances ou de constituants interférents dans la matrice, qui co-existent avec les composés d’intérêt.
Le premier problème à résoudre est la complexité de l’analyse proprement dite, due à la présence d’un grand nombre d’entités qui doivent être séparées afin d’identifier et de quantifier le ou les composés d’intérêt. Voir la figure 2.
Figure 2. Exemple d’un échantillon complexe.
L’analyse peut ne pas être assez robuste, car tout changement aussi léger soit-il peut avoir un impact sur la résolution de la séparation d’une paire critique d’analytes.
Il faut également tenir compte du fait que la présence de toutes les interférences dans la matrice d’origine peut entraîner l’immobilisation de l’instrument en raison de la contamination qui s’accumule à chaque injection. Si les interférences étaient éliminées lors de la préparation des échantillons, les composés d’intérêt pourraient alors être analysés avec une méthode plus simple et plus robuste. On peut le voir à la figure 3, qui compare l’échantillon d’origine en haut et le nouvel échantillon préparé par SPE en bas.
Figure 3. Comparaison de complexités de matrice.
Un autre avantage de la simplification de la matrice est l’amélioration de l’exactitude de la quantification. Le tracé bleu au-dessus pour le composé 1 sur la figure 4 semble initialement acceptable. Cependant, il s’avère effectivement contaminé par la matrice si on le compare au tracé rouge de la matrice vierge juste en dessous. Avec un protocole SPE approprié, les tracés inférieurs présentent les mêmes composés sans problèmes d’interférence, ce qui rend la quantification bien plus précise.
Figure 4. Amélioration de la quantification grâce à une meilleure préparation des échantillons.
La figure 5 illustre un autre exemple. Le tracé du haut montre une importante interférence de la matrice sur les deux composés 1 et 2. Le tracé du bas montre une nette amélioration des résultats (ligne de base nette) grâce à une préparation adéquate des échantillons par SPE. Notez qu’une ligne de base beaucoup plus nette améliore l’exactitude des résultats analytiques. En outre, il est possible d’obtenir un extrait beaucoup plus pur si l’échantillon nécessite l’isolement et la purification de ce composé.
Figure 5. Amélioration significative de la ligne de base grâce à la technologie SPE.
2. Réduction de la suppression ou amplification ionique lors des analyses MS.
Le deuxième problème posé par les matrices complexes s’observe au niveau de la sortie du spectromètre de masse (LC/MS ou LC-MS/MS). Pour une réponse correcte du signal MS (sensibilité), l’ion composé doit pouvoir se former correctement. Lorsque la formation de l’ion composé est supprimée par des interférences dans la matrice, l’intensité du signal est fortement diminuée.
Cet effet est visible sur la figure 6. La sortie du haut représente le signal de nos composés d’intérêt lorsqu’ils sont injectés dans une solution saline. Le tracé du bas montre une réduction importante de la réponse (suppression > 90 %) de ces mêmes composés lorsqu’ils ont été analysés dans du plasma humain. Pour le tracé du bas, seule une étape ordinaire de précipitation des protéines a été réalisée. Cette technique n’élimine pas les interférences de la matrice à l’origine de la suppression ionique, ce qui entraîne une mauvaise réponse du signal.
Figure 6. Exemple de suppression ionique due à la matrice.
La figure 7 illustre un autre exemple parlant de cet effet de suppression. Dans le tracé du haut de la sortie MS, où l’échantillon de plasma a été préparé avec une simple étape de précipitation des protéines, nous pouvons voir que le pic de terfénadine est supprimé à 80 %. Dans le tracé du bas, où le même échantillon a été préparé avec une méthode SPE, la suppression ionique est minimale. Étant donné que les interférences de la matrice ont été éliminées, l’ion composé a pu se former correctement, créant ainsi un meilleur signal.
Figure 7. Réduction de la suppression ionique avec une méthode SPE adéquate.
Dans certains cas, les interférences de la matrice peuvent augmenter artificiellement le signal rapporté pour un composé. C’est ce qu’on appelle l’amplification ionique, qui entraîne une valeur rapportée élevée incorrecte. Une méthode SPE adéquate minimise cet effet en éliminant les interférences du composé, ce qui permet d’obtenir une valeur rapportée plus précise.
3. Possibilité de fractionner la matrice pour analyser les composés par classe
Un analyste confronté à un échantillon renfermant de nombreux composés devra les séparer par classe afin de pouvoir effectuer une analyse plus efficace. Par exemple, la formulation d’une boisson non alcoolisée contient une grande diversité de composés. Une méthode SPE pourrait être développée pour séparer les différentes classes de composés, par exemple en fonction de leur polarité. Les composés polaires pourraient être recueillis, sous forme de fraction séparée, à partir des composés plus apolaires. Ces deux fractions pourraient alors être analysées séparément de manière beaucoup plus efficace, car leurs composés seraient plus similaires.
La figure 8 montre un exemple de la puissance de fractionnement par SPE. Ici, un échantillon complexe d’une poudre sèche (préparation pour boisson au raisin rouge) est facilement séparé en quatre fractions : une fraction composée uniquement des composés polaires, un composé rouge purifié, un composé bleu purifié et une fraction contenant tous les autres composés très apolaires. Vous verrez ailleurs dans ce manuel à quel point cette fonctionnalité peut être puissante.
Figure 8. Préparation des échantillons par SPE.
Pour une description plus détaillée du fractionnement d’échantillon par SPE, consultez la page 125 dans la section consacrée au développement de méthodes.
4. Concentration (enrichissement) de composés présents à l’état de trace
À l’heure actuelle, les analystes doivent souvent identifier des composés à des niveaux de concentration bien plus faibles qu’auparavant, de l’ordre des parties par billion (ppt pour « parts per trillion »), voire moins. Généralement, ces niveaux sont inférieurs dans l’échantillon pur à la sensibilité des instruments d’analyse.
Un bon exemple est l’analyse des contaminants présents à l’état de trace dans les échantillons environnementaux ou le développement dans le temps des métabolites dans les fluides biologiques. Dans la figure 9, le tracé du haut montre la faible réponse de l’échantillon pur d’origine pour le composé d’intérêt. Dans les mêmes conditions analytiques, mais avec l’échantillon préparé par SPE utilisé dans une stratégie de concentration de traces, le tracé du bas montre une augmentation spectaculaire de l’intensité du signal pour ce composé. À l’aide de ce résultat, il est possible de calculer précisément la concentration du composé d’origine dans l’échantillon pur.
Figure 9. Exemple de concentration de composés présents à l’état de trace.
Sans la capacité de rétention des matériaux de remplissage chromatographique de la SPE, il serait très difficile, voire impossible, de concentrer un ou plusieurs composés spécifiques présents à l’état de trace avec d’autres méthodes de préparation des échantillons.
Récapitulatif
Comme nous l’avons vu, un dispositif SPE avec lit chromatographique peut remplir quatre fonctions essentielles pour rendre l’analyse de l’échantillon plus efficace. Voir la figure 10.
Figure 10. La puissance de la SPE.
Dans ce manuel, nous nous sommes efforcés de présenter tous les principes de base de la SPE ainsi que les techniques fructueuses décrites par des scientifiques du monde entier qui ont pu compter sur cette technologie au cours des 30 dernières années. Aujourd’hui, les scientifiques estiment que la SPE est plus utile que jamais pour résoudre les problèmes épineux de préparation des échantillons et d’analyse.
Nous espérons que ce manuel vous permettra de comprendre et de maîtriser les fonctionnalités de la SPE afin que vous puissiez à votre tour exploiter la puissance de cette technologie dans votre laboratoire.
Dans ce guide technique
Manuel d’initiation à la SPE
SPE – Enrichissement et purification des échantillons par extraction en phase solide
