Einführung in die präparative SFC

Säulen-Screening

Bevor eine Zielverbindung chromatographisch isoliert werden kann, ist eine Methodenentwicklung erforderlich. Dies wird in der Regel im analytischen Maßstab durchgeführt, um Lösungsmittel, Zeit und Proben zu sparen. Bei der SFC kann die Retention einzelner Komponenten eines Gemischs an einer definierten stationären Phase nicht vorhergesagt werden. Im Gegensatz zur RP-LC ist die Identifizierung der richtigen Säulenchemie bei SFC-Trennungen entscheidend und der wichtigste Faktor bei der Entwicklung von SFC-Methoden. Daher ist es wichtig, sich auf eine effiziente Screening-Strategie zu verlassen, um die Qualität der Trennung in Bezug auf das/die Aufreinigungsziel(e) zu maximieren. Die Entwicklung der stationären Phase verläuft zurzeit sehr dynamisch und eine kleine Anzahl von chemischen Verbindungen könnte sich in der Zukunft als bevorzugte Säulen erweisen. Heutzutage verwenden die meisten Anwender einen automatisierten Screening-Prozess, bei dem die „besten“ Säulen für ihre Applikation verwendet werden.

Bei der Auswahl eines geeigneten Säulensatzes für das Screening müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden. L/dp (Länge/Partikelgröße) muss zwischen der analytischen Trennsäule und der späteren präparativen Säule eingehalten werden, daher sollten nur analytische Säulen geeigneter Größe in Betracht gezogen werden. Dies gewährleistet die Kontinuität der Chromatographie zwischen den Systemen beim Scale-up. Die Säulen sollten einen weiten Selektivitätsbereich aufweisen und für die Art der Probe geeignet sein. So retenieren beispielsweise hochpolare Verbindungen (wie Kohlenhydrate) auf einer C₁₈-Säule wahrscheinlich nicht, während eine Silikatsäule für extrem hydrophobe (unpolare) Verbindungen (wie die meisten Carotinoide) wahrscheinlich nicht optimal ist. Säulen können auch nach ihrer Eignung für basische oder saure Verbindungen oder beidem klassifiziert werden.

Für die chirale Aufreinigung sind chirale Säulen erforderlich. Aufgrund der komplexeren Wechselwirkung der stationären Phase mit den Zielverbindungen ist mehr "Trial and Error" (Ausprobieren) nötig, um die beste Säule für chirale Trennungen zu bestimmen. Einige Säulen haben jedoch eine höhere Trefferquote als andere. Zum Beispiel sind chirale Phasen, die von Zellulose und Amylose abgeleitet sind, wegen ihres weiten Applikationsbereichs beliebt, während andere chirale Phasen, wie z. B. die Pirkle-Phase, wegen ihrer hohen chemischen Stabilität beliebt sind. Chirale Phasen können auch erfolgreich für achirale Applikationen eingesetzt werden, insbesondere mit positionellen Isomeren oder eng verwandten Verbindungen.

Das Säulen-Screening wird in der Regel unter Verwendung von Lösungsmitteln mit Gradientenbedingungen durchgeführt, in der Regel zwischen 2 % und 50 % Hilfslösungsmittel. Diese Bedingungen geben dem Anwender eine gute Vorstellung davon, welche Säule für die Isolierung der Zielverbindung optimal ist, und liefern gleichzeitig einen guten Hinweis darauf, welche Prozentsätze des Hilfslösungsmittel für die Elution der Verbindung erforderlich sind. Abbildung 14 ist ein Beispiel für ein chirales Säulen-Screening für die Trennung von (R) und (S)-Goitrin (einem aktiven Naturstoff, der in der Wurzel von Isatis Indigotica Fort vorkommt) unter Verwendung von fünf stationären Phasen auf Zellulose- und Amylosebasis (IC, OJ-H, AS-H, OD-H und AD-H) und einer stationäre Pirkle-Phase (S,S)-Whelk-O1. Ein Beispiel für ein Screening auf einer achiralen Säule ist in Abbildung 15 zu sehen, bei dem ein Gemisch aus drei Carotinoiden auf vier achiralen stationären Phasen gescreent wird. Beachten Sie, dass die Carotinoide am besten an C₁₈ reteniert werden und nicht an den anderen polareren Phasen.

Lösungsmittel-Screening

CO₂ allein ist im Allgemeinen für die Elution von Verbindungen von einer Chromatographiesäule nicht ausreichend – daher wird normalerweise ein polares Hilfslösungsmittel zugesetzt. Die Auswahl des Hilfslösungsmittels ist ein Schlüsselparameter bei der Entwicklung und Optimierung chromatographischer SFC-Methoden. Für die meisten Applikationen kann eine Vielzahl von Hilfslösungsmitteln und Gemischen verwendet werden, um die Trennung zu optimieren. Die Auswahl an kompatiblen Lösungsmitteln in der SFC kann überwältigend erscheinen. Sie kann jedoch vereinfacht werden, indem man beide Enden des Polaritätsspektrums miteinander verbindet: unpolares CO₂ mit hochpolaren organischen Lösungsmitteln, was zu einer mobilen Phase führt, die einen großen Bereich der Lösungsmittelstärke abdeckt.

Die vier am häufigsten verwendeten Hilfslösungsmittel sind Methanol, Ethanol, Isopropanol und Acetonitril, wobei Methanol die stärkste und Acetonitril die schwächste Polarität aufweist. Normalerweise wird Methanol oder Ethanol für das Säulen-Screening und das anfängliche Lösungsmittel-Screening empfohlen. Isopropanol und Acetonitril eignen sich zur Optimierung der Methode oder für Fälle, in denen Ethanol oder Methanol keine akzeptable Auflösung liefern. Kombinationen dieser Lösungsmittel können in vielen Fällen eine Feinabstimmung der Polarität der mobilen Phase bewirken. Zum Beispiel schwächt die Zugabe von Acetonitril zu Ethanol das Hilfslösungsmittel, was die Retention erhöht und eine andere Selektivität bereitstellt. Normalerweise nimmt die Retention zu, wenn die Stärke des Hilfslösungsmittels abnimmt. Genau wie bei der LC nimmt die Retention ab, wenn der Anteil des starken Lösungsmittels steigt (Abbildung 16). Manchmal kann jedoch aufgrund der niedrigen Viskosität des CO₂ die Gesamtflussrate erhöht werden (bei demselben Prozentsätze des Hilfslösungsmittel), was zu einer schnelleren Laufzeit bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Trennung führt (Abbildung 17).

Additive im Hilfslösungsmittel

Schärfere Peaks und eine bessere Auflösung sind in der präparativen Chromatographie wichtig, da breite Peaks und eine schlechte Löslichkeit katastrophale Folgen für die Produktivität haben können. Peak-Tailing bei der SFC kann durch die Verwendung von Additiven im Anteil des Hilfslösungs der mobilen Phase unterdrückt werden, wodurch der Bereich gelöster Stoffe erweitert wird, der für eine mobile Phase auf CO₂-Basis zugänglich ist.

Die Verwendung von CO₂ als chromatographisches Lösungsmittel führt zu einer leicht sauren mobilen Phase, wenn es mit anderen polaren organischen Lösungsmitteln kombiniert wird. Da eine mobile Phase auf CO₂-Basis leicht sauer ist, weisen viele saure und neutrale Verbindungen akzeptable Peakformen auf, ohne dass ein Additiv für die mobile Phase erforderlich ist. Bei einigen sauren Verbindungen können jedoch saure Additive die Peakform verbessern (Abbildung 18). Gebräuchliche saure Additive umfassen Trifluoressigsäure, Ameisensäure und Essigsäure. Applikationen, die basische Verbindungen enthalten, erfordern zur Verbesserung der Chromatographie in der Regel ein basisches Additiv (üblicherweise zwischen 0,1 und 1 %) (Abbildung 19). Gängige basische Additive sind sekundäre oder tertiäre Amine wie Isopropylamin (IPA), Diethylamin (DEA) oder Triethylamin (TEA). Diese Additive sind selbst in sehr niedrigen Konzentrationen (bis zu 0,01 % im Hilfslösungsmittel) äußerst wirksam, sie können jedoch die MS-Detektion stören und bei einigen Säulenchemien (insbesondere bei reinem Silika) Memory-Effekte aufweisen. Daher werden auch Ammoniumacetat und Ammoniumhydroxid verwendet, da sie Säulen- und MS-freundlicher sind und das MS-Signal sogar verstärken können.

Zusätzlich zu den klassischen Hilfslösungsmitteln sind viele neue Säulen mit nicht-klassischen Hilfslösungsmitteln oder Additiven kompatibel, darunter Ethylacetat, Tetrahydrofuran, Dichlormethan, Chloroform oder Dimethoxymethan. Diese Kombinationen ermöglichen es, Retentionszeiten und Selektivität noch weiter zu modulieren, während die Probenlöslichkeit verbessert wird. Ein nicht-klassischer Zusatzstoff, der immer beliebter wird, ist Wasser. Wasser ist nicht mit CO₂ mischbar. Wenn es jedoch als Zusatz in einem stark polaren Hilfslösungsmittel (wie Methanol) verwendet wird, ist Wasser eine ausgezeichnete Wahl, um die Löslichkeit und Peakform hydrophiler Verbindungen in der SFC zu erhöhen.Die tolerierbare Wassermenge hängt vom Anteil des Hilfslösungsmittels an der gesamten mobilen Phase ab. Schließlich wird aufgrund der Phasentrennung (Unmischbarkeit) in der mobilen Phase Basislinienrauschen beobachtet. Normalerweise können 1 bis 5 % Wasser in polaren Hilfslösungsmittel effektiv verwendet werden. Mit Wasser als Zusatzstoff können stärker polare Verbindungen mit der Prep SFC aufgereinigt werden.

Zu Aufreinigungszwecken ist es am besten, die Verwendung von Additiven zu vermeiden, die nachgeschaltet entfernt werden müssen. Wenn zur Trennung Additive erforderlich sind, sollten flüchtige Additive, die leicht entfernt werden können, in der niedrigsten wirksamen Konzentration verwendet werden. Alternativ gibt es jetzt neue stationäre Phasen, die den Bedarf an Additiven insgesamt reduzieren, was der Prep SFC einen erheblichen Vorteil bietet.

Löslichkeit und Retentionsfaktor aller Verbindungen sind eng mit der Flüssigkeitsdichte verbunden.

Die Dichte der mobilen Phase entlang der Säule ist von großer Bedeutung, da sie die physikalischen und chemischen Eigenschaften der mobilen Phase steuert. Ein interessantes Merkmal der SFC ist die Möglichkeit, die Dichte der mobilen Phase mithilfe von Temperatur und Druck zu steuern. Während die Wahl der Säule und mobilen Phase den größten Einfluss auf die Trennung in der SFC hat, werden Temperatur und Druck zur Feinabstimmung oder Optimierung einer Trennung verwendet. Von den beiden Parametern hat der Druck den größten Einfluss auf die Chromatographie; mit steigendem Druck nimmt die Dichte zu, was in der Regel zu einer geringeren Retentionszeit und Auflösung führt (Abbildung 20). Höhere Temperaturen führen andererseits zu einer geringeren Dichte und längeren Retentionszeiten. Mit der Temperatur ist der Effekt jedoch verbindungsabhängig und kann zu einer Änderung der Auflösung oder sogar der Elutionsreihenfolge bei eng eluierenden Verbindungen führen. Dies wurde häufiger bei chiralen Trennungen beobachtet (Abbildung 21).

Der Druck wird mithilfe eines Rückdruckreglers (BPR, back pressure regulator) gesteuert, der den „Rückdruck“ des Systems nach der Säule einstellt. Obwohl die Systeme für einen weiten Druckbereich ausgelegt sind (bis zu 400 bar Sollwerte), wird der Rückdruckregler in der Prep SFC in der Regel auf 100 bis 200 bar (1450 bis 2901 psi) eingestellt.Die Temperaturen werden durch Sollwerte entweder mithilfe eines Ofens (Beheizen der Säule) oder eines Wärmetauschers (Beheizen der mobilen Phase) gesteuert.

 Typische Temperatursollwerte liegen zwischen 40 und 60 °C. Einige Applikationen werden bei unterkritischen Bedingungen (flüssiges CO₂) durchgeführt, wobei die Temperaturen zwischen 25 und 35 °C niedriger eingestellt werden, während der Druck relativ hoch gehalten wird. Es wird nicht empfohlen, bei Drücken und Temperaturen in der Nähe des kritischen Punkts zu arbeiten, da bei diesen Bedingungen kleine Temperatur- oder Druckänderungen zu großen Änderungen der Dichte (und der Chromatographie) führen. Sowohl Temperatur- als auch Druckbeschränkungen hängen normalerweise mit der Robustheit der Säulenchemie oder -packung zusammen.

Optimieren der Bedingungen der mobilen Phase

Die Wahl der optimalen Kombination aus Lösungsmittel und Säule ist in der Regel applikations- oder zielspezifisch. Im Idealfall sorgen eine hohe Beladung, eine gute Auflösung und eine schnelle Trennung für eine vollständige Wiederfindung des Ziels bei hoher Reinheit. In der Praxis sind jedoch in der Regel Kompromisse erforderlich, um die produktivste Lösung zu ermitteln. Beispielsweise können die Peaks gut getrennt werden (was eine hohe Beladung ermöglicht). Dies benötigt aber eine längere Laufzeit. Andererseits würde eine gute Trennung mit einer deutlich kürzeren Laufzeit eine schnellere Zykluszeit ermöglichen, jedoch möglicherweise mit einer geringeren Beladung. Ein weiterer Aspekt ist die nachgelagerte Prozessierung oder Fraktionswiederfindung, bei der die Menge oder Art des Lösungsmittels ein wichtiger Faktor sein kann. Wenn die Trennung unter isokratischen Bedingungen durchgeführt werden kann, können schließlich Stacked Injections verwendet werden, was die Produktivität erheblich verbessert. Sobald eine Säule und ein Lösungsmittel ausgewählt sind, können andere Parameter manipuliert werden, um die Trennung vor dem Scale-up und der Aufreinigung zu optimieren.

Optimieren der Gradientenbedingungen: In der SFC funktionieren fokussierte Gradienten nicht so wie in der RP-LC. Aufgrund der vielen konkurrierenden Retentionsmechanismen bei der Normalphasenchromatographie können Änderungen des Gradienten unterschiedliche Auswirkungen auf die Retention verschiedener Analyten haben. Insbesondere bei der SFC gibt es auch eine Änderung der Dichte und des Druckabfalls, die mit der Zunahme des Hilfslösungsmittels über den Gradienten einhergeht. Mit zunehmender Menge an Hilfslösungsmittel ist der Effekt nicht linear auf die Retentionszeit, was es schwierig macht, die Selektivität der Verbindungen unter den veränderten Bedingungen vorherzusagen. Für strukturell ähnliche Verbindungen ist dies weniger problematisch, da sie ähnlichen Retentionsmechanismen folgen. Proben, die Mischungen von strukturell unterschiedlichen Verbindungen enthalten (z. B. in einer Matrix), stellen eine größere Herausforderung dar. Im Allgemeinen führen flachere Gradienten jedoch zu längeren Retentionszeiten und einer besseren Auflösung.

Bestimmung isokratischer Bedingungen: Isokratische Methoden sind ideal, da sie einfach auf Basis der Screening-Ergebnisse zu entwickeln sind und Stacked Injections verwendet werden können, um die Produktivität zu verbessern. Mithilfe der Retentionszeit, der Steigung des Screening-Gradienten und des Ausgleichs der Verzögerung durch das System- und Säulenvolumen können die Prozentsätze des Hilfslösungsmittels bei der Elution bestimmt werden. In der SFC liegt der beste Ausgangspunkt für die Optimierung normalerweise 5 % unter dem berechneten Prozentsatz.

Der Screening-Gradient betrug 2 bis 20 % über 5 Minuten und die Gradientenverzögerung betrug 0,46 Minuten (zuvor bestimmt). Bei einer berechneten Steigung von 3,6 %/min und einem Anfangsprozentsatz von 2 % wurde der Prozentsatz des Hilfslösungsmittels bei der Elution des ersten Peaks nach 4,12 Minuten mithilfe der folgenden Gleichung berechnet:

■ Hilfslösungsmittel-% bei Elution = (Retentionszeit – Gradientenverzögerung) x Gradientensteigung + Startprozentsatz

■ Hilfslösungsmittel-% bei Elution = (4,12 min – 0,46 min) x 3,6 %/min + 2 %

■ Hilfslösungsmittel-% bei Elution = 15 %

Daher wurden nach Subtraktion von 5 % isokratische Bedingungen mit 10 % Hilfslösungsmittel als Ausgangspunkt für die Optimierung verwendet. Die resultierende Chromatographie zeigte eine gute Trennung, aber durch die Erhöhung des Anteils an Hilfslösungsmittel der mobilen Phase auf 15 % wurden die Peaks bei kürzerer Laufzeit immer noch gut aufgelöst. In diesem Fall würde die 10-%-Methode eine höhere Beladung ermöglichen und die 15-%-Methode schnellere Zykluszeiten.

System-Skala

Für die Prep SFC sind Geräte mit einer Kapazität von Flussraten von 2 mL/min bis zu mehreren hundert mL/min verfügbar, um die für das Arbeiten auf verschiedenen Skalen erforderlichen Anforderungen zu erfüllen. Bei einem korrekten Workflow muss der Umfang der Aufreinigung dem Ziel der Applikation entsprechen. Dies ist besonders wichtig, wenn die Probe begrenzt ist oder eine geringe Löslichkeit aufweist. In diesem Fall ist ein Aufreinigungssystem in kleinerem Maßstab (semi-prep) praktischer. Bei der SFC werden Aufreinigungen im kleinen Maßstab normalerweise mit Säulen, deren Innendurchmesser zwischen 4,6 und 10 mm liegt, bei Flussraten von 3 bis 20 mL/min durchgeführt. Eine Tabelle, die die Säulengröße mit den Flussraten und der ungefähren Beladbarkeit in der Prep SFC abgleicht, ist unten aufgeführt (Tabelle 5). Es ist wichtig zu beachten, dass die Beladbarkeit für eine bestimmte Probe von vielen Faktoren abhängt, einschließlich der Löslichkeit, der Auflösung des Ziels und der relativen Menge der Zielverbindung zur Matrix.

In größeren Prep-SFC-Systemen werden Säulen mit einem Innendurchmesser von 18 bis 50 mm bei Flussraten von 50 bis 350 mL/min verwendet. Die größere Säulenkapazität ermöglicht eine höhere Beladung pro Injektion und höhere Flussraten, wodurch der Durchsatz für diese Applikationen optimiert wird. In der allumfassenden Welt der Aufreinigung gelten diese Systeme als mittelgroße Systeme. Große Prep-SFC-Systeme im Pilotmaßstab (hier nicht behandelt) werden in vielen etablierten industriellen Prozessen eingesetzt. Diese verwenden sehr große (30 cm Innendurchmesser oder größer) Hochdruck-Chromatographiesäulen mit dynamischer Axialkompression (DAC, dynamic axial compression) und werden normalerweise als Betriebsanlagen betrieben.

Workflows: „Bulk“ oder „Batch“

Je nach Applikation werden in der Prep-SFC zwei grundlegende Arbeitsabläufe verwendet. Die erste wird als „Bulk“-Aufreinigung bezeichnet. Bei diesem Workflow wird eine einzelne große Probenmenge mehrmals injiziert, bis die erforderliche Menge des/der Zielstoff(e) zurückgewonnen wurde oder die Probe aufgebraucht ist. Alle passenden gesammelten Fraktionen werden in einer begrenzten Anzahl von Sammelflaschen gepoolt. „Bulk“-Mengen an Material werden über mehrere Stunden (oder manchmal sogar Tage) verarbeitet und zurückgewonnen. Typischerweise ist dies eine UV-gerichtete Aufreinigung, obwohl andere Detektionsmethoden verwendet werden können. In diesem Fall sind die Proben normalerweise gut charakterisiert und verstanden und eine hohe Produktivität ist das Ziel.

Für viele „Bulk“-Applikationen werden Stacked Injection verwendet. Stacked Injections verbessern den Durchsatz erheblich, da der gesamte zur Verfügung stehende Platz in der Chromatographie für die kontinuierliche Trennung und Aufreinigung genutzt wird. Im Wesentlichen reduzieren Stacked Injections die Zeit zwischen den Injektionszyklen und minimieren den Lösungsmittelverbrauch noch weiter. Ein Beispiel für Stacked Injections ist in Abbildung 22 zu sehen. Bei einigen Applikationen können mehrere Injektionen durchgeführt werden, bevor der erste Peaksatz eluiert ist. Damit die Stacked Injections genutzt werden können, muss das System in der Lage sein, die Injektionen durchzuführen, während die Sammlungen durchgeführt werden. Daher wird ein separates Injektionsmodul oder ein System verwendet, das zur autonomen Bewegung der Sammel- und Injektionseinheiten (Nadeln und Sprühköpfe) in der Lage ist.

„Batch“-Aufreinigung bezieht sich auf einen Workflow, der für die Aufreinigung von Bibliotheken am praktischsten ist, oder wenn mehrere Proben mit mehreren Zielen aufgereinigt werden müssen. Normalerweise wird eine massengesteuerte Aufreinigung durchgeführt, da diese beim Sammeln von Fraktionen selektiver ist. Bei optischer (oder UV-) gerichteter Aufreinigung können die Peaks vom Detektor nicht unterschieden werden. Viele Verbindungen absorbieren bei derselben Wellenlänge. Bei der massengesteuerten Aufreinigung werden Fraktionen auf der Grundlage der Masse gesammelt. Dies ist ein sehr viel spezifischerer Parameter, da er zwischen dem/den Zielstoff(en) und etwaigen Verunreinigungen unterscheidet. Dies ist besonders nützlich, wenn die Proben komplexe Matrices aufweisen, nicht gut charakterisiert sind oder durch UV nicht detektiert werden können, da sie keine Chromophore enthalten. Typischerweise werden Gradientenmethoden verwendet, um die Peakform zu verbessern und Verbindungen besser von komplexen Störungen zu trennen. Dieser Workflow verwendet die Open-bed-Sammlung in mehrere Röhrchen; typischerweise bildet jedes Röhrchen eine einzelne Fraktion. Die Proben werden als „Batch“ gemessen und die Zielverbindungen werden anhand ihrer Massen gesammelt. Die Batch-Aufreinigung kann auch mit reinem UV- oder mit UV- und MS-Triggern durchgeführt werden. Ein Beispiel für eine MS-basierte Aufreinigung von Zielverbindungen aus Naturstoffen ist in Abbildung 23 zu sehen.