Einführung in die präparative SFC

Flussweg und Hardware

Dank der Fortschritte bei modernen präparativen SFC-Geräten wurden viele Hindernisse überwunden, die bei der präparativen SFC auftreten können. Abbildung 7 zeigt den allgemeinen Flussweg bei Geräten für die präparative SFC. Die SFC verwendet denselben grundlegenden Flussweg wie die HPLC, einschließlich binärer Pumpen- und Methodensteuerung, Probenzuführung in den Flussweg mithilfe von Injektionen, säulenbasierte Trennungen, Peakerkennung und Fraktionssammlung. Bei der SFC sind zusätzliche Technologien erforderlich, vor allem, um die Komprimierbarkeit und Ausdehnung von CO₂ zu regeln. Dazu gehören Wärmetauscher (Heat Exchanger – HE), Rückdruckregler (Back Pressure Regulator – BPR), Gas-Flüssigkeitsabscheider (Gas Liquid Separator – GLS) und die fast universelle Verwendung von Hochdruckleitungen aus Edelstahl.

Überlegungen für jede Komponente

Pumpen: Bei der SFC werden, wie bei der LC, binäre Pumpsysteme verwendet, um ein "A"-Lösungsmittel, in diesem Fall immer CO₂, und ein "B"-Lösungsmittel, in der Regel ein polares organisches Lösungsmittel wie Methanol, zu fördern. Je nach Maßstab des Systems wird das CO₂ auf zwei Arten zugeführt, entweder volumetrisch (Volumenstrom), was typisch für den Analysemaßstab ist, oder nach Masse (Massenstrom), wie es häufig im präparativen Maßstab der Fall ist. Da CO₂ komprimierbar ist, entsprechen gleiche Volumina aufgrund von Dichteunterschieden nicht unbedingt der gleichen Masse. Beide Zuführungsmethoden sind nützlich, solange die Flussraten unabhängig von den Umgebungsbedingungen reproduzierbar sind. In den meisten Fällen wird das CO₂ entweder vor der Pumpe oder in den Pumpenköpfen gekühlt und dann als Flüssigkeit gepumpt, um Unterschiede in der Dichte der mobilen Phase zu verringern. Außerdem müssen alle Dichtungen, Rückschlagventile, Kapillaren und Fittings in der Lage sein, eine unter hohem Druck stehende, komprimierbare Flüssigkeit ohne Leckage zu verarbeiten. Da sich CO₂ durch jede Öffnung leicht ausdehnt, kann selbst eine kleine Undichtigkeit große Auswirkungen auf die Systemleistung und die Chromatographie haben. Ein schlechtes Pumpen des CO₂, sei es aufgrund von Undichtigkeiten in den Leitungen, Dichtungen oder Rückschlagventilen, kann nicht nur Änderungen der Retentionszeit und Selektivität, sondern auch eine schlechte Druck-(Dichte-) Regelung und Basislinienrauschen zur Folge haben.

Injektionen: Es gibt zwei häufig verwendete Injektionsmodi, Mischstrom und Modifikatorstrom, die im Abschnitt „Injektionsstrategien bei der SFC“ ausführlich besprochen werden. Die SFC-Injektionsschemata mit Mischstrom beinhalten einen Druckentlastungsschritt, um vor dem Laden der Probe jegliches CO₂ aus der Schleife abzulassen. Um die Sicherheit zu gewährleisten, wird die Druckentlastung manchmal auch in Systemen angewandt, die sowohl Mischstrom- als auch Modifizierungsstrom-Injektionen durchführen. Normalerweise erfolgt dies mit einem sekundären „Entlüftungsventil“. Ein Nachteil dieser Einrichtung ist das zusätzliche Säulenvolumen, das während der Injektion zum System hinzugefügt wird und zu einer Peakverbreiterung und einer geringeren Auflösung führen kann. Durch die Verwendung von Kapillaren mit kleinem Innendurchmesser, die das Volumen auf ein Minimum reduzieren, wird die Peakverbreiterung eingeschränkt.

Säulenofen und Heizung: Bei der SFC sind Druck und Temperatur Methodenparameter, die die Trennung beeinflussen, da sie sich auf die Dichte der mobilen Phase auswirken. Daher ist eine angemessene Beheizung und Temperaturkontrolle der mobilen Phase und der Säule erforderlich. Wenn die Temperatur nicht ordnungsgemäß geregelt wird, können sich in der Säule auftretende Temperaturgradienten nachteilig auf die Peakform und Auflösung auswirken. Bei vielen SFC-Systemen wird dies entweder durch Beheizen der Säule in einem Ofen oder durch Beheizen der mobilen Phase oder durch beides erreicht.

Die Wahl der richtigen Säulenchemie (sowohl chiral als auch achiral) ist bei der SFC von entscheidender Bedeutung. Daher ist bei SFC-Applikationen ein Säulenscreening erforderlich. Viele SFC-Systeme sind mit einem Schaltventil ausgestattet, das sich im Ofen befindet, um zwischen mehreren Säulen zu wählen. Dies ist besonders bei Applikationen wichtig, bei denen viele verschiedene Proben und Targets aufgereinigt werden müssen, für die wahrscheinlich unterschiedliche Säulenchemien erforderlich sind.

Detektoren: Alle typischen Detektionstechniken, die bei der Aufreinigung verwendet werden, wie UV/Vis, PDA, MS und ELS, sind mit der SFC kompatibel, und es können mehrere Detektoren in einem einzigen System verwendet werden. In der Regel werden UV/Vis- und PDA-Detektoren im Hauptflussweg angeschlossen, da sie zerstörungsfreie Detektoren sind und für den primären Nachweis verwendet werden. Die Flusszellen für diese Detektoren müssen für die bei der SFC verwendeten Drücke entsprechend ausgelegt sein. Destruktive Detektoren wie MS und ELS werden mit einer Splittertechnologie ausgestattet, die eine relative Kontrolle des Splitverhältnisses ermöglicht und das Lösungsmittel so konditioniert, dass das Detektionssignal optimiert wird. Es können mehrere Detektorsignale (oder Kanäle) aufgezeichnet oder zur Fraktionstriggerung verwendet werden, wodurch der Applikationsbereich der Technologie sowohl für die analytische als auch für die präparative SFC erweitert wird. Die Verwendung dieser Detektoren in der SFC wird im Abschnitt „Optische und MS-Detektion bei der SFC“ dieses Kapitels ausführlicher behandelt.

Rückdruckregler (BPR): Die Steuerung der Dichte der mobilen Phase entlang der Säule ist einer der wichtigsten Faktoren bei der Entwicklung von SFC-Geräten, da die Löslichkeit und der Retentionsfaktor aller Verbindungen eng mit der Flüssigkeitsdichte verbunden sind. Die Dichtesteuerung wird hauptsächlich durch die Steuerung des Drucks im System erreicht. Der Rückdruckregler ist ein automatisches Gerät, mit dem der Druck nach der Säule (Rückdruck) des Systems auf einen in der Methode angegebenen Druck geregelt werden kann. Um eine geeignete, wiederholbare Chromatographie durchzuführen, muss der Druck nach der Säule auch unter Gradientenbedingungen und von Messung zu Messung konstant bleiben (am Sollwert). 

Auch wenn CO₂ oberhalb von 74 bar (~ 1073 psi) und 31 °C als überkritisch gilt, wird ein Betrieb in der Nähe des kritischen Punkts normalerweise nicht empfohlen, da kleine Temperatur- oder Druckänderungen in diesem Bereich zu großen Dichteänderungen führen. Daher wären in diesem Bereich entwickelte Methoden in Bezug auf Retention und Auflösung weniger robust. Außerdem ist bei der Verwendung von Hilfslösungsmitteln bei niedrigen Drücken die Wahrscheinlichkeit einer Phasentrennung höher, was Basislinienrauschen zur Folge hat. Daher werden bei den meisten SFC-Methoden höhere Drucksollwerte verwendet, in der Regel mehr als 100 bar (1450 psi).

Trigger für das Sammeln: Bei der Prep SFC kann das Sammeln auf mehreren Kanälen und Detektoren mithilfe von Erfassungsmodi für Schwellenwert, Zeit und Steigung (in Tabelle 3 definiert) ausgelöst werden. Für ein intelligenteres Sammeln wird die Boolesche Logik verwendet, bei der mehr als eine Bedingung erfüllt sein muss, bevor die Erfassung erfolgt. Die Bedingungen für das Sammeln können Kombinationen von Modi wie Schwellenwert und Zeit oder Kombinationen von Detektorsignalen wie UV-Schwellenwert und Bestätigung der Masse umfassen.

Tabelle 3. Definitionen der Erfassungsmodi, die bei der präparativen SFC verwendet werden.

Die zeitliche Verzögerung der Erfassung ist ebenfalls wichtig, und für eine optimale Wiederfindung der Zielverbindungen müssen geeignete Verzögerungen zwischen dem Detektor und dem Erfassungssystem festgelegt werden. Genau wie bei der präparativen HPLC sind diese Verzögerungen von den Flussraten abhängig. Bei der SFC gehen jedoch Änderungen der Sammelzeit auch mit Änderungen in der Zusammensetzung der mobilen Phase und des Drucks einher. Durch die Verwendung von Zusatzlösungsmitteln und anderen Technologien zur Abschwächung der CO₂-Ausdehnung kann der Zeitpunkt bei einer eingestellten Flussrate unter verschiedenen Bedingungen besser gesteuert werden.

Injektionsstrategien bei der SFC

Derzeit gibt es zwei Ansätze für die Probeninjektion bei SFC-Applikationen: Mischstrom und Modifikatorstrom. Bei der Mischstrom-Injektion durchläuft die gesamte mobile Phase (CO₂ und Hilfslösungsmittel) die Schleife und transportiert die Probe zur Säule. Häufige Probleme bei der Mischstrom-Injektion sind Peakverzerrungen und Verschiebungen der Retentionszeit, die durch die Auswirkungen starker Verdünnungsmittel verursacht werden. Standardmäßig wird die Probe im polaren Modifikator (Hilfslösungsmittel) gelöst. Die Verwendung eines starken Lösungsmittels wie Methanol führt dazu, dass ein Teil des Analyten von der stationären Phase nicht absorbiert wird, was einen Peakdurchbruch oder eine Peakverzerrung zur Folge hat. Bei Peaks, die weniger zurückgehalten werden, ist die Auswirkung größer und die Verzerrung wird stärker. Wenn das Injektionsvolumen zunimmt, verursacht der Strom des polaren Lösungsmittels eine lokale Störung in der mobilen Phase, wodurch die Peaks noch weiter verzerrt werden, während gleichzeitig die Auflösung verringert wird. Diese Injektionsstrategie erfordert auch einen Druckabbau, der sich auf die Injektionsbeladung und die Wiederholbarkeit auswirken kann. Bei Mischstrom-Injektionen wurde gezeigt, dass Verdünnungsmittel mit einer ähnlichen Polarität wie CO₂ (wie Hexan, Heptan oder andere unpolare Lösungsmittel) die Peakform verbessern (Abbildung 8).

Die zweite Injektionsstrategie ist die Modifikatorstrom-Injektion, bei der die Probe vor dem Mischen mit CO₂ in den organischen Teil der mobilen Phase (Hilfslösungsmittel) injiziert wird. Dies ist vergleichbar mit den Verdünnungsschemata an der Säule, die bei der LC-Aufreinigung verwendet werden. Die Idee dahinter ist, den Einfluss des Verdünnungsmittels abzumildern, indem die Probe eingeführt wird, ohne die Gesamtstärke der mobilen Phase zu beeinflussen, und die programmierten Lösungsmittelprozentsätze während der Injektion und der Messung beizubehalten. In diesem Fall sollte das Verdünnungsmittel zu dem für die Trennung verwendeten Hilfslösungsmittel passen; es können jedoch auch andere Verdünnungsmittel verwendet werden. Die Modifikatorstrom-Injektion bietet eine verbesserte Peakform und Auflösung, wodurch größere Injektionsvolumina und eine höhere Beladung möglich sind (Abbildung 9).

Bei Verwendung der Modifikatorstrom-Injektion bei niedrigen Prozentsätzen von Hilfslösungsmitteln dauert das Aufbringen der Probe auf den Kopf der Säule aufgrund der niedrigen Flussrate der Hilfslösungsmittelpumpe länger. Aufgrund der hochgradig diffundierenden mobilen Phase kann die längere Injektionszeit im Vergleich zu Mischstrom-Injektionen zu breiteren Peaks führen. Die Peakform ist jedoch im Vergleich zu Mischstrom-Injektionen mit hohem Volumen bei niedrigen Prozentsätzen von Hilfslösungsmitteln immer noch besser. Auch wenn die Probe im Mischstrom schneller in die Säule gelangt, übertrifft das Ausmaß der Störung unter diesen Bedingungen jeden Nutzen. Wenn der prozentuale Anteil an Hilfslösungsmittel zunimmt, wird die Wahl der Injektionstechnik weniger kritisch, bei niedrigen Prozentsätzen an Hilfslösungsmitteln ist jedoch der Modifikatorstrom deutlich besser.

PDA- und UV/Vis-Detektion

Es gibt SFC-spezifische Überlegungen, wenn es um die optische Detektion bei der SFC geht. Änderungen der Dichte der mobilen Phase und Unterschiede der Brechungsindizes zwischen CO₂ und dem Hilfslösungsmittel führen bei UV/Vis- und PDA-Detektoren zu Basisliniendrift und Rauschen. Diese Effekte sind unter Gradientenbedingungen besonders ausgeprägt. Bei den PDA-Detektoren kann die Basislinie mithilfe einzelner Wellenlängenkanäle und einer Wellenlängenkompensation angepasst werden, um das Basislinienrauschen zu reduzieren und die Empfindlichkeit zu erhöhen (Abbildung 10). Bei UV/Vis-Detektoren führt die Einstellung einer einzigen Wellenlänge dazu, dass das Basislinienrauschen und die Drift weniger ausgeprägt sind.

Für die Hardware wurden spezifische Flusszellen für die hohen Drücke von SFC-Applikationen entwickelt. Diese können in Waters 2998 PDA und 2489 UV/Vis Detektoren verwendet werden. Die Designeigenschaften von Flusszellen, einschließlich Pfadlänge, Geometrie und Zellenmaterial, wurden untersucht, um die Detektion bei SFC-Applikationen zu optimieren.

MS-Detektion

Einer der großen Vorteile der SFC ist die Möglichkeit, Normalphasenselektivität mit MS-Kompatibilität zu kombinieren. Das CO₂ bei der SFC ersetzt nicht nur inkompatible Lösungsmittel wie Hexane und Heptane, sondern unterstützt durch die Gasexpansion auch die Zerstäubung und Partikelbildung in der MS-Quelle. Die SFC ist mit der ESI-, APCI- und Dualmodus-Aufnahme von zahlreichen MS-Geräten kompatibel. Der Waters ACQUITY QDa Detektor ist bei der präparativen SFC besonders nützlich, da er einfach zu bedienen ist. Bei niedrigen Prozentsätzen an Hilfslösungsmitteln sind jedoch häufig nicht genügend Ionen für eine optimale Signalerkennung vorhanden. Aus diesem Grund wird in der Regel ein Konditionierungslösungsmittel (oder Zusatzlösungsmittel) bei der Trennung zugegeben, um das Signal im MS zu verstärken. Ein typisches Konditionierungslösungsmittel enthält ein Gemisch aus Methanol, Wasser und einem Additiv (oft Ammoniumhydroxid oder Ameisensäure). Je nach den Vorlieben des Anwenders, dem Typ des MS-Geräts und dem Umfang der Applikation werden viele andere Gemische von Konditionierungslösungsmitteln mit unterschiedlichen Flussraten verwendet. Beispiele für den MS-ESI-Nachweis auf einem Waters ACQUITY QDa Detektor mit und ohne Konditionierungslösungsmittel sind in Abbildung 11 zu sehen.

ELS-Detektion

SFC ist auch mit der ELS-Detektion kompatibel. Genau wie bei der MS wird ein Split verwendet und Zusatzlösungsmittel hinzugefügt, um das Signal zu verbessern. Da die mobile Phase der SFC so flüchtig ist, wird das zusätzliche Lösungsmittel benötigt, um die Probe zu transportieren und ein besseres Signal im ELS-Detektor zu erhalten. Im Betrieb wird der ELSD für die SFC ähnlich wie für die LC gesteuert.

Sammeln mit der Prep SFC: Hinweise zur CO₂-Ausdehnung

Die Eigenschaften einer expandierenden mobilen Phase sind wichtig, wenn es um die Steuerung der Erfassung in Prep SFC geht. Am kritischen Punkt bei 31 °C und 74 bar beträgt die volumetrische Ausdehnung von reinem CO₂ auf Atmosphärenbedingungen (1 bar und 15 °C) etwa das 250-fache.

In präparativen SFC-Systemen tritt CO₂ unter hohem Druck am Rückdruckregler (BPR) aus. Diese volumetrische Ausdehnung nimmt exponentiell zu, wenn der Druck des austretenden CO₂ steigt. In binären Systemen, wie der mobilen Phase der typischen SFC, nimmt die Ausdehnung ab, wenn der CO₂-Anteil sinkt und der organische Anteil zunimmt. Wenn die Ausdehnung eintritt, nimmt die Auflösungskapazität der mobilen Phase sowohl durch das Fehlen des Solvatationsvermögens als auch durch die Joule-Thomson-Kühlung ab. Die Abkühlung kann auch zur Bildung von Trockeneis führen, das die Leitungen verstopfen kann. Eine fehlende Ausdehnungskontrolle kann zu einer Verzerrung der Peaks im Sammelflussweg führen, was die Reinheit der Fraktion beeinträchtigt. Dies kann auch einen Verlust der Wiederfindung zur Folge haben, da die Zielverbindungen dem Abfall zugeführt werden oder durch Verdampfung an der Sammelstelle verloren gehen.

Um Fraktionen erfolgreich zu sammeln, gibt es bei SFC-Geräten viele Strategien, um die CO₂-Ausdehnung und ihre Auswirkungen zu kontrollieren. Um die Abkühlung und die damit verbundenen Probleme zu verringern, wird die mobile Phase zunächst am anfänglichen Ausdehnungspunkt direkt nach dem Rückdruckregler erhitzt. Zweitens wird in vielen Fällen ein organisches Zusatzlösungsmittel zugesetzt, das nicht nur die Verbindungen in Lösung hält, sondern auch dazu beiträgt, die Ausdehnung zu kontrollieren, indem der volumetrische Anteil von CO₂ verringert wird. Die bessere Kontrolle der Ausdehnung verbessert die Peakformen nach dem Rückdruckregler und die Wiederfindung. Schließlich wird das CO₂ abgeleitet oder entfernt. In der Regel wird zu diesem Zweck eine Art Phasentrennvorrichtung verwendet, wie z. B. Hochdruckzyklone oder Gas-Flüssigkeitsabscheider (GLS) (Abbildung 12).

Hochdruckzyklone drücken den schwereren (flüssigen) Teil der mobilen Phase nach außen und zum Boden des Zyklons, während das CO₂-Gas aus der Mitte und von der Oberseite entweichen kann. Vorteilhafterweise benötigen Hochdruckzyklone kein Zusatzlösungsmittel (sogar bei niedrigeren Prozentsätzen an Hilfslösungsmittel), da die Solvatationskraft des CO₂ durch das Sammelventil aufrechterhalten wird und in den Zyklonen eine Phasentrennung auftritt. Allerdings gibt es auch einige Nachteile. Hochdruck-Sammelsysteme erfordern Hochdruckmaterialien wie Edelstahl und stellen aufgrund des Sprühnebels und der Ausdehnung, die mit der Wiederfindung von Fraktionen verbunden sind, ein erhöhtes Sicherheitsrisiko dar. Diese Systeme beschränken den Anwender auch auf eine begrenzte Anzahl von Positionen, die für die Open-bed-Sammlung zur Verfügung stehen. Der Gas-Flüssigkeitsabscheider (GLS) ist eine alternative Niederdruckoption, die viele Vorteile bietet. Niederdrucksysteme ermöglichen die Verwendung von Materialien mit niedrigerem Druckwert und weisen ein erheblich geringeres Sicherheitsrisiko auf. Und obwohl für das Sammeln in der Regel zusätzliches Lösungsmittel erforderlich ist, ermöglicht die vollständigere Entfernung von CO₂ bei niedrigem Druck die Open-bed-Sammlung wodurch die Anzahl der Fraktionen, die gesammelt werden können, beträchtlich erhöht und die Anwendbarkeit der Technologie erweitert wird.

Vielfältige Selektivität und Anwendbarkeit

Die Prep SFC bietet eine außergewöhnliche Steigerung der Selektivität im Aufreinigungsprozess. Während bei der SFC im Allgemeinen die Normalphasentrennung eingesetzt wird, ist diese Technik äußerst flexibel, da sie den Einsatz einiger konventioneller RPLC-Säulen und Lösungsmittel ermöglicht, wodurch der Bereich der Verbindungskompatibilität erweitert wird. Die Möglichkeit, diesen weiten Selektivitätsbereich abzudecken, ist ein klarer Vorteil der SFC, da sie eine orthogonale Trennung innerhalb einer einzigen Plattform ermöglicht, wodurch der gesamte Aufreinigungsprozess rationalisiert wird.

SFC-Kompatibilität: Löslichkeit

Die SFC wird grundsätzlich in einem chromatographischen Normalphasen-Trennmodus betrieben. Unter typischen Betriebsbedingungen ist der Großteil der mobilen Phase unpolares CO₂, gepaart mit einem geringen Anteil eines polaren organischen Lösungsmittels, und die Trennung erfolgt auf gepackten Säulen mit kleinen Partikeln, die relativ polare stationäre Phasen mit einem breiten Spektrum an Funktionalität enthalten. Aufgrund der niedrigen Viskosität der mobilen Phase und der Säulen mit kleinen Partikeln wird die SFC hauptsächlich bei Applikationen mit kleinen Molekülen verwendet. Der Bereich der Applikationen mit höherem Molekulargewicht, die unter Verwendung von SFC durchgeführt werden, wird jedoch ständig erweitert. Ansonsten hängt die Eignung einer Verbindung für die SFC hauptsächlich von der Löslichkeit ab. Die SFC hat einen extrem großen Löslichkeitsbereich. Grundsätzlich ist jede Probe, die in einem organischen Lösungsmittel gelöst werden kann, für die SFC geeignet. Dies ist sehr nützlich, da viele Techniken der Probenvorbereitung dazu führen, dass Proben in organischen Lösungsmitteln gelöst werden, die direkt in die Prep SFC injiziert werden können.

Eine nützliche Information über die Löslichkeit einer Verbindung in organischen Lösungsmitteln ist der Verteilungskoeffizient, üblicherweise als LogP bezeichnet. Im Allgemeinen ist der LogP ein Maß für die Lipophilie oder Hydrophobie einer Verbindung. Insbesondere ist es das Konzentrationsverhältnis einer Verbindung in den zwei Phasen eines Gemischs von zwei nicht mischbaren Lösungsmitteln im Gleichgewicht; normalerweise Wasser und 1-Octanol. Da CO₂ ein unpolares Lösungsmittel ist, sind LogP-Werte ein guter Indikator dafür, wie sich eine Verbindung unter SFC-Bedingungen verhält. Niedrige LogP-Werte weisen auf eine höhere Polarität hin, die zu einer geringeren Löslichkeit in CO₂ und mehr Affinität für die polaren Säulenchemien führt, während hohe LogP-Werte auf eine niedrige Polarität hinweisen, was zu mehr CO₂-Löslichkeit und weniger Affinität für die Säule führt. Das Gegenteil ist bei der RP-LC der Fall, bei der die mobile Phase polar und die stationäre Phase unpolar ist.

Bei analytischen (UPC²) Applikationen können mit geringerer Beladung und weniger konzentrierten Proben Verbindungen mit LogP-Werten zwischen -2 und 9 erfasst werden. Bei der präparativen SFC ist es jedoch wichtig, dass Verbindungen unter hoher Beladung in Lösung bleiben, wenn sie dem CO₂ zugeführt werden. Proben, die sehr polare oder hydrophile Verbindungen in präparativen Konzentrationen und Mengen enthalten, sollten vor der Injektion in das System auf Löslichkeit getestet werden. Dies geschieht in der Regel durch Auflösen der Probe in einem geeigneten organischen Lösungsmittel und die anschließende Zugabe einer kleinen Menge Hexan oder Heptan. Wenn die Probe aus der Lösung ausfällt, wird sie im Allgemeinen als nicht geeignet für die präparative SFC betrachtet.

Ein Nachteil der Prep SFC ist die schlechte Löslichkeit von hochpolaren Verbindungen. Durch die Zugabe einer kleinen Menge Wasser (als Additiv, normalerweise weniger als 5 % v:v) zum organischen Anteil der mobilen Phase kann die SFC jedoch für einen noch breiteren Bereich der Probenpolarität verwendet werden. Das Wasser erhöht die Löslichkeit hydrophiler Verbindungen und ermöglicht so die Trennung und Aufreinigung dieser Verbindungen. Der Applikationsbereich der SFC kann daher auf die Untersuchung von Peptiden, Proteinen, Nukleobasen und anderen hydrophilen Analyten erweitert werden. Während sich diese Technik bei polaren Applikationen bewährt hat, sollte sie bei der präparativen SFC mit Vorsicht angewendet werden, um Probenablagerungen oder Eisbildung am Systemauslass zu vermeiden.

SFC-Anwendbarkeit: Hilfslösungsmittel

Die Auswahl des Hilfslösungsmittels ist bei der SFC ein Schlüsselparameter für die Entwicklung und Optimierung chromatographischer Methoden. Sowohl bei der normalen als auch bei der Reversed-Phase-Flüssigchromatographie gibt es Einschränkungen hinsichtlich der Mischbarkeit von Lösungsmitteln. Die aliphatischen Kohlenwasserstoffe in Normalphasen und das Wasser in Umkehrphasen schränken den Polaritätsbereich der Lösungsmittel ein, die bei diesen Trennungen verwendet werden können. Bei der SFC ist überkritisches CO₂ sowohl mit organischen Umkehrphasen- als auch mit Normalphasen-Lösungsmitteln mischbar, von Methanol bis Heptanen, was eine breite Palette von Selektivitätsoptionen für Lösungsmittel für die Entwicklung einer Trennung eröffnet. Dieser große Selektivitätsbereich vergrößert den Bereich der SFC-kompatiblen Applikationen erheblich.

SFC-Anwendbarkeit: Säulen

Bei der Reversed-Phase-Chromatographie werden die meisten Trennungen an einer begrenzten Anzahl von stationären Phasen durchgeführt, typischerweise C₁₈- oder ähnliche hydrophobe Säulen. Für die SFC stehen zahlreiche chirale und achirale Säulenchemien zur Verfügung, die sowohl den Bereich der unpolaren (Reversed-Phase) als auch den der polaren (Normalphase) Säulen abdecken. Basische, neutrale und saure Verbindungen werden von den meisten Säulen gut eluiert, was auf die Eignung von Prep SFC für einen weiten Bereich chemischer Funktionalitäten hinweist. Die Verwendung verschiedener Säulen kann als Nachteil angesehen werden, bietet jedoch auch die Möglichkeit, die Selektivität für die Aufreinigung einer bestimmten Verbindung zu optimieren. Moderne stationäre Phasen der Prep SFC bieten ein zusätzliches Potenzial für den verstärkten Einsatz von SFC für chirale und achirale Aufreinigungen. Insbesondere die Viridis- und Torus-Säulen von Waters wurden speziell für die SFC-Applikation entwickelt und bieten eine bessere Stabilität, einen breiten Selektivitätsbereich und eine bessere Peakform, wodurch der Bedarf an Additiven verringert wird. Tabelle 4 enthält eine Liste von Waters Säulen, die den Applikationsbereich von Prep SFC abdecken. Die Säulenauswahl ist ein wichtiger Parameter bei der Methodenentwicklung und -optimierung.

Chirale Trennung

Die SFC ist bei weitem die beste Chromatographielösung zur Trennung chiraler Verbindungen und bietet im Vergleich zu anderen Chromatographietechniken wie Normalphasen-HPLC erhebliche Verbesserungen bei der Trennleistung und -geschwindigkeit. Chirale Trennungen werden in der Regel mittels Normalphasen-HPLC erreicht. Bei der SFC werden diese Trennungen in wesentlich kürzerer Zeit durchgeführt, während gleichzeitig die Auflösung erhöht und der Lösungsmittelverbrauch reduziert wird.

Chirale Säulen werden daher in der SFC-Umgebung häufig verwendet, nicht nur für chirale Applikationen, sondern auch für die Trennung von Diastereomeren, Metaboliten, Regioisomeren und anderen strukturell ähnlichen Verbindungen. Die Phasen auf Cellulose- und Amylosebasis sind zwar am gebräuchlichsten, aber auch andere chirale stationäre Phasen sind kompatibel. Dies hat Vorteile bei der Aufreinigung dieser Verbindungen, wie z. B. eine höhere Reinheit der Fraktionen, eine höhere Effizienz und Kosteneinsparungen aufgrund eines geringeren Lösungsmittelverbrauchs. Abbildung 13 zeigt die chirale Trennung der Enantiomere und Diastereomere von Permethrin mithilfe von Normalphasen-HPLC und SFC.

Nicht alle vier Peaks konnten mittels HPLC aufgelöst werden; sie wurden jedoch in kürzerer Zeit und mit einer kürzeren Säule mit SFC aufgelöst.