Leitfaden zu UPLC

Im vorherigen Abschnitt wurde der Vorteil kleinerer chromatographischer Partikel und einer minimierten Bandenverbreiterung des Systems [sowohl Gerät als auch Säule] beschrieben. Die UPLC-Technologie ermöglicht eine verbesserte chromatographische Leistung durch Minimierung der Bandenverbreiterung des Systems, um effizientere Trennungen in kürzerer Zeit durchzuführen und so eine bessere Datenqualität zu erreichen. Die Bandenverbreiterung ist jedoch nicht der einzige Faktor, der die Leistung bestimmt, die mit kleinen Partikeln erzielt werden kann. Auch der verfügbare Druck des Geräts spielt eine große Rolle.

Druck wird von Natur aus erzeugt, wenn die mobile Phase durch die Verbindungsleitungen von der Pumpe zum Injektor, vom Injektor zur Säule, durch die Säule selbst, die Kapillare nach der Säule sowie die Detektorzelle fließt. Die Messung des Systemdrucks ist ein kumulativer Effekt all dieser Komponenten [Gerät und Säule]. Wenn die Flussrate erhöht wird, steigt der Druck, der von der durch die Verbindungsleitung selbst fließenden mobilen Phase erzeugt wird. Außerdem beeinflusst der Innendurchmesser und die Länge der Kapillare, wie viel Druck in Kombination mit der Flussrate erzeugt wird. Die Druckdifferenz zwischen zwei Säulen kann mit theoretischen Vorhersagen verglichen werden, wenn der vom Gerät selbst erzeugte Druck vom Gesamtsystemdruck [Gerät + Säule] subtrahiert wird.

Wenn die Partikelgröße verringert wird, nimmt der Gegendruck mit einer Rate zu, die umgekehrt proportional zum Quadrat des Partikeldurchmessers ist. Gleichzeitig nimmt die optimale Geschwindigkeit der mobilen Phase [Lineargeschwindigkeit] mit abnehmendem Partikeldurchmesser zu. Daher nimmt der Druck bei der optimalen Lineargeschwindigkeit für eine gegebene Partikelgröße mit einer Rate zu, die umgekehrt proportional zur dritten Potenz des Partikeldurchmessers ist [Abbildung 44].

Dies ist eine erhebliche Einschränkung beim Versuch, Säulen mit kleineren Partikeln auf herkömmlichen HPLC-Geräten zu verwenden, um die chromatographische Auflösung zu verbessern [konstante Säulenlänge bei gleichzeitiger Verringerung der Partikelgröße] oder um die Analysegeschwindigkeit bei Beibehaltung der Auflösung zu verbessern [konstantes L/d_p-Verhältnis]. Aufgrund der Druckbegrenzungen herkömmlicher HPLC-Geräte

[350 – 400 bar; 5000 – 6000 psi] führt die Verwendung kleinerer Partikel oft zu einer Einschränkung der Säulenlänge oder zu einem Betrieb mit suboptimalen Lineargeschwindigkeiten [Flussraten].

Bei einer konstanten Säulenlänge sagt die Theorie voraus, dass bei einer Verringerung der Partikelgröße von 5,0 µm auf 1,7 µm [3´ Abnahme der Partikelgröße] ein Anstieg des Gegendrucks auf 27´ zu erwarten ist. Der Systemdruck erhöhte sich um 22´ beim Übergang von einer 5,0-µm-Säule zu einer 1,7-µm-Säule der gleichen Länge, was nahezu den theoretischen Voraussagen entsprach. Wie zu erkennen ist, arbeitet die 1,7-µm-Säule deutlich über der oberen Druckgrenze eines herkömmlichen HPLC-Geräts [Abbildung 45].

Der starke Anstieg des Gegendrucks, der durch abnehmende Partikelgrößen beobachtet wird, ist einer der Hauptgründe, warum Säulen mit Sub-2-µm-Partikeln [und entsprechende LC-Geräte] bis zur Einführung des ACQUITY UPLC Systems kommerziell nicht erfolgreich waren.

Wenn das Trennungsziel darin besteht, die Auflösung beizubehalten und gleichzeitig die Analysezeit zu verkürzen [Konstanthaltung des L/d_p-Verhältnisses], ist der Druckanstieg viel geringer als das Konstanthalten der Säulenlänge bei gleichzeitiger Verringerung der Partikelgröße. Die Druckänderung ist aufgrund der proportionalen Verringerung der Säulenlänge umgekehrt proportional zum Quadrat der Partikelgröße [und nicht zur Partikelgröße hoch drei].

In diesem Beispiel sind sowohl Säulenlänge als auch Partikelgröße um 3´ reduziert [Abbildung 47]. Dies bedeutet, dass der Rückdruck voraussichtlich um 9´ ansteigen wird. Die beobachteten Werte stimmen mit den theoretischen Vorhersagen überein. Wenn L/d_p konstant gehalten wird, wird beim Übergang von einer 150 mm langen 5,0-µm-Säule zu einer 50 mm langen 1,7-µm-Säule ein Anstieg des Gegendrucks um 11´ beobachtet.

Bei Betrieb mit der optimalen Flussrate übersteigt der von kleineren Partikeln erzeugte Druck die Druckbegrenzungen konventioneller HPLC-Systeme. Das ACQUITY UPLC System [obere Druckgrenze von 1030 bar, 15.000 psi] wurde für diese Drücke entwickelt, sodass Partikel unter 2 µm bei ihrer optimalen Flussrate erfolgreich betrieben werden können.

Erhöhte Temperatur

Eine Möglichkeit, die durch kleine Partikel erzeugten höheren Drücke auszugleichen, besteht darin, die Säulentemperatur zu erhöhen. Wenn die Säulentemperatur erhöht wird, nimmt die Viskosität der mobilen Phase ab, was zu einem geringeren Gegendruck führt [wenn die Flussrate konstant gehalten wird]. Jedoch nimmt die Geschwindigkeit, mit der sich Analytmoleküle in die Poren der stationären Phase hinein und aus diesen heraus bewegen [Diffusion], zu, was dazu führt, dass die Flussrate erhöht werden muss, um die Leistung aufrechtzuerhalten.

Beim Erhöhen der Säulentemperatur von 30 °C auf 90 °C muss die Flussrate erhöht werden, um die Effizienz aufrechtzuerhalten [Abbildung 48]. Beim Vergleich der höchsten Bodenzahl bei beiden Temperaturen wird keine Effizienzsteigerung beobachtet, was mit der chromatographischen Theorie übereinstimmt.

Ein interessanterer Vergleich kann gezogen werden, wenn die Bodenzahl gegen den Systemdruck aufgetragen wird [Abbildung 49]. Durch diese Darstellung der Daten ist deutlich zu erkennen, dass unabhängig von der Trenntemperatur die maximale Säuleneffizienz bei etwa demselben Systemdruck erreicht wird. Dies bedeutet, dass erhöhte Temperaturen nicht verwendet werden können, um die mit der Verwendung kleiner Partikel verbundenen Drücke zu umgehen. Mit anderen Worten, ein herkömmliches HPLC-Gerät ist für die effiziente Verwendung sehr kleiner Partikel nicht geeignet.