Leitfaden zu UPLC

Ein Probengemisch wird aus einem Probenvial in einen sich bewegenden Flüssigkeitsstrom [mobile Phase] überführt. Die Probe wird dann von der mobilen Phase von einer Hochdruckpumpe zum Kopf einer chromatographischen Säule befördert. Die Mischung aus mobiler Phase und injizierter Probe tritt in die Säule ein, passiert das Partikelbett und verlässt diese, wobei die getrennte Mischung zu einem Detektor geleitet wird [Abbildung 3].

Betrachten wir zunächst, wie die Probenbande in einzelne Analytbanden aufgeteilt ist [die Flussrichtung wird durch grüne Pfeile dargestellt]. Abbildung 4A stellt die Säule zum Zeitpunkt Null [dem Zeitpunkt der Injektion] dar, wenn die Probe in die Säule eintritt und beginnt, eine Bande zu bilden. Die hier gezeigte Probe, eine Mischung aus gelben, roten und blauen Farbstoffen, erscheint am Einlass der Säule als eine einzelne schwarze Bande.

Nach einigen Minuten, in denen die mobile Phase kontinuierlich und gleichmäßig durch die Packungsmaterialpartikel fließt, können wir sehen, dass sich die einzelnen Farbstoffe in getrennten Banden mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegt haben [Abbildung 4B]. Dies liegt daran, dass eine Konkurrenz zwischen der mobilen Phase und der stationären Phase besteht, um jeden der Farbstoffe oder Analyten anzuziehen. Beachten Sie, dass sich die gelbe Farbstoffbande am schnellsten bewegt und im Begriff ist, die Säule zu verlassen. Der gelbe Farbstoff hat eine größere Affinität für die mobile Phase als die anderen Farbstoffe [er wird von ihr angezogen]. Daher bewegt er sich mit einer schnelleren Geschwindigkeit, näher an der der mobilen Phase. Die blaue Farbstoffbande hat eine größere Affinität für das Packungsmaterial als die mobile Phase. Ihre stärkere Anziehungskraft auf die Partikel führt dazu, dass sie sich erheblich langsamer bewegt. Mit anderen Worten, es ist die am meisten zurückgehaltene Verbindung in diesem Probengemisch. Die rote Farbstoffbande hat eine mittlere Anziehungskraft für die mobile Phase und bewegt sich daher mit einer mittleren Geschwindigkeit durch die Säule. Da sich jede Farbstoffbande mit einer anderen Geschwindigkeit bewegt, können wir das Gemisch chromatographisch trennen.

Wie aus einer chromatographischen Bande ein Peak wird

Jede spezifische Analytbande besteht aus vielen Analytmolekülen. Die Mitte der Bande enthält die höchste Konzentration an Analytmolekülen; während die Vorder- und Hinterkanten der Bande mit zunehmender Grenzfläche zur mobilen Phase immer weniger konzentriert sind [Abbildung 5].

Wenn die getrennten Farbstoffbanden die Säule verlassen, werden sie sofort in einen Detektor geleitet. Der Detektor sieht [erkennt] jede getrennte Verbindungsbande vor dem Hintergrund einer mobilen Phase [siehe Abbildung 6]. Ein geeigneter Detektor [UV, ELS, Fluoreszenz, Masse usw.] kann das Vorhandensein einer Verbindung erkennen und das entsprechende elektrische Signal an eine Computerdatenstation senden, wo es als Peak aufgezeichnet wird. Der Detektor reagiert auf die variierende Konzentration der spezifischen Analytmoleküle innerhalb der Bande, wobei das Zentrum der Bande [höchste Population von Analytmolekülen] vom Detektor als der Scheitelpunkt des Peaks interpretiert wird.

Was ist ein Chromatogramm?

Ein Chromatogramm ist eine Darstellung der Trennung, die chemisch [chromatographisch] im HPLC-System stattgefunden hat. Auf der Zeitachse werden eine Reihe von Peaks gezeichnet, die von einer Basislinie aus ansteigen. Jeder Peak stellt das Detektorsignal für eine andere Verbindung dar. Das Chromatogramm wird von der Computerdatenstation dargestellt [siehe Abbildung 6]. Die gelbe Bande hat die Flusszelle des Detektors vollständig passiert. Das erzeugte elektrische Signal wurde an die Computerdatenstation gesendet. Das resultierende Chromatogramm erscheint auf dem Bildschirm. Beachten Sie, dass das Chromatogramm mit der ersten Injektion der Probe beginnt und als gerade Linie unten auf dem Bildschirm startet. Dies wird Basislinie genannt; sie stellt die reine mobile Phase dar, die die Flusszelle im Laufe der Zeit durchläuft. Wenn die gelbe Analytbande die Flusszelle passiert, wird ein Signal [das je nach Konzentration der Analytmoleküle variiert] an den Computer gesendet. Die Kurve verläuft zunächst nach oben, dann nach unten, proportional zur Konzentration des gelben Farbstoffs in der Probenbande. Dadurch entsteht im Chromatogramm ein Peak. Nachdem die gelbe Bande die Detektorzelle vollständig verlassen hat, kehrt der Signalpegel zur Basislinie zurück; die Flusszelle enthält jetzt wieder nur reine mobile Phase. Da sich die gelbe Bande am schnellsten bewegt und zuerst von der Säule eluiert, ist sie der erste gezeichnete Peak. Wenig später erreicht die rote Bande die Flusszelle. Das Signal steigt von der Basislinie an, wenn die rote Bande zum ersten Mal in die Zelle eintritt, und der Peak, der die rote Bande darstellt, wird nun gezeichnet. In diesem Diagramm hat die rote Bande die Flusszelle nicht vollständig passiert. Das Diagramm zeigt, wie die rote Bande/der Peak aussehen würde, wenn der Prozess zu diesem Zeitpunkt angehalten würde. Da der Großteil der roten Bande die Zelle passiert hat, wurde der größte Teil des Peaks gezeichnet, wie durch die durchgezogene Linie dargestellt. Wenn wir mit dem chromatographischen Verfahren fortfahren würden, würde die rote Bande die Flusszelle vollständig passieren und der rote Peak wäre vollständig [gepunktete Linie]. Die blaue Bande, die am stärksten zurückgehalten wird, bewegt sich mit der geringsten Rate und wird nach der roten Bande eluiert. Die gepunktete Linie zeigt, wie das fertige Chromatogramm aussehen würde, wenn der Lauf bis zum Ende fortgesetzt würde. Interessant ist, dass der blaue Peak am breitesten ist, da die blaue Analytbande am schmalsten auf der Säule ist, aber am breitesten, sobald sie die Säule verlässt. Dies liegt daran, dass sie sich langsamer durch das chromatographische Packungsmaterial bewegt und mehr Zeit [und Volumen der mobilen Phase] benötigt, um vollständig eluiert zu werden. Da die mobile Phase kontinuierlich mit einer festen Rate fließt, verbreitert sich die blaue Bande und ist stärker verdünnt. Der Detektor reagiert proportional zur Konzentration der Bande, daher ist der blaue Peak niedriger und breiter.

Bandenverbreiterung

Bevor die Probe/Analytbande den Detektor erreicht, durchläuft sie mehrere Komponenten des Chromatographiesystems, die zur Verzerrung und Verbreiterung der chromatographischen Bande beitragen [Abbildung 7]. Dieses Phänomen wird als Bandenverbreiterung bezeichnet. Wenn die Analytbande breiter wird, wird die resultierende chromatographische Peakbreite erhöht. Die breitere Bande führt zu einem Verdünnungseffekt, der eine Abnahme der Peakhöhe mit einem Verlust an Empfindlichkeit und Auflösung zur Folge hat. Umgekehrt werden bei einer Minimierung der Bandenverbreiterung schmalere chromatographische Banden erreicht, was eine höhere Effizienz zur Folge hat. Diese höheren, schmaleren chromatographischen Peaks sind für den Detektor leichter zu erkennen, was aufgrund einer konzentrierteren Analytbande eine höhere Empfindlichkeit und Auflösung ermöglicht. Es ist daher wichtig, die Faktoren zu kennen, die die Bandenverbreiterung beeinflussen, um diese Einflüsse zu reduzieren und zu kontrollieren, damit die chromatographische Gesamtleistung verbessert wird.

Innerhalb eines Chromatographiesystems tragen sowohl Einflüsse der Säule als auch die außerhalb der Säule [alles außerhalb der Säule] zur Bandenverbreiterung bei. Quellen außerhalb der Säule umfassen das Injektionsvolumen, den Flüssigkeitsweg des Geräts zwischen dem Probeninjektor und der Säule und vom Ausgang der Säule zum Detektor [einschließlich der Flusszelle] und allen darin enthaltenen Verbindungen. Zu den Quellen der Bandenverbreiterung in der Säule gehören die Partikelgröße des Packungsmaterials, wie gut das Material in der Säule gepackt ist und seine Diffusionseigenschaften in Bezug auf die Geschwindigkeit der mobilen Phase, die Größe des Analyten und die Geometrie. Die Summierung der Varianzen (σ2) für jeden dieser Faktoren beeinflusst die Breite eines Peaks [Abbildung 8].

Um eine signifikant verbesserte Leistung bei der Flüssigchromatographie zu erreichen, müssen sowohl die Einflüsse der Bandenverbreiterung der zusätzlichen Säule als auch der Säule reduziert werden. Das ACQUITY UPLC System basiert auf dem Konzept, beide Formen der Bandenverbreiterung so zu reduzieren, dass effektive Verbesserungen in Bezug auf Effizienz und Empfindlichkeit erzielt werden [Abbildung 9].

Umgang mit Bandenverbreiterung außerhalb der Säule [vom Gerät]

Um eine signifikante Verbesserung der chromatographischen Leistung zu erzielen, wurde erheblicher technischer Aufwand betrieben, um ein LC-Gerät zu entwickeln, das die Drücke aufnehmen kann, die von Packungen mit kleinen Partikeln [unter 2 µm] erzeugt werden, während die Dispersion des Flusswegs minimiert wird, sodass eine theoretische Leistung von der Trennsäule erreicht werden konnte. Ebenso wichtig ist, dass das Gerät ein zuverlässiges, robustes und präzises Analysewerkzeug für den routinemäßigen Gebrauch im Labor darstellt. Um die Bedeutung des Gerätedesigns zu veranschaulichen, muss man verstehen, wie sich die Systemdispersion [Bandenverbreiterung Gerät + Säule] auf chromatographische Ergebnisse auswirken kann.

Die Messung der Bodenzahl [N] oder Effizienz berücksichtigt die Dispersion eines Peaks. Die Breite eines Peaks steht im direkten Zusammenhang zur Breite der Analytbande beim Passieren des Detektors, während der Scheitelpunkt dieses Peaks der Punkt ist, an dem die größte Konzentration von Analytmolekülen innerhalb dieser Bande vorliegt. Diese Messung wird unter isokratischen Bedingungen durchgeführt.

Die Gleichung der Bodenzahl kann wie in Abbildung 10 dargestellt abgeleitet werden, wobei [Vn] das Elutionsvolumen des Peaks, [w] die Peakbreite und [a] eine Konstante ist, die auf der Basis der Peakhöhe bestimmt wird, bei der die Peakbreite gemessen wird. Jede Methode zur Messung der Peakbreite liefert identische Ergebnisse der Bodenzahl, solange der Peak perfekt symmetrisch ist. Wenn der Peak Fronting oder Tailing aufweist, liefern diese Messmethoden unterschiedliche Ergebnisse.

Es ist ein weit verbreiteter Irrtum, dass sich die Bodenzahl nur auf die von der Säule selbst erreichte Leistung bezieht. Die Bandenverbreiterung sowohl von der Säule als auch vom Gerät beeinflusst jedoch auch die Peakbreite, aus der die Bodenzahl bestimmt wird. Um den Einfluss des Geräts auf die Bandenverbreiterung zu demonstrieren, wurde eine einzelne HPLC-Säule auf zwei verschiedenen Geräten verwendet: ein Standard HPLC [Peakverbreiterung = 7,2 µL] und ein ACQUITY UPLC System [Peakverbreiterung = 2,8 µL]. Da auf beiden Systemen dieselbe Säule verwendet wird, wird der Beitrag der Bandenverbreiterung der Säule konstant gehalten. Die beim ACQUITY UPLC System beobachtete Effizienzsteigerung zeigt, dass ein Gerät mit weniger Bandenverbreiterung schmalere Peakbreiten erzeugt, was zu einer höheren Bodenzahl führt [Abbildung 11].

Der Einfluss von Länge und Durchmesser der Kapillare

Nachdem die Probenbande in den Flüssigkeitsstrom eingeführt wurde, bewegt sie sich zur Säule. Der ACQUITY UPLC Sample Manager wurde entwickelt, um den Abstand zwischen Injektor und Säuleneinlass zu minimieren, um die Bandenverbreiterung zu minimieren. Die Säule trennt die Probenbande in einzelne Analytbanden. Dann werden die chromatographisch getrennten Analytbanden von der Säule auf den Detektor übertragen. Auf den ersten Blick scheint die Bedeutung des Innendurchmessers [ID] der Kapillare, die den Säulenauslass und den Detektoreinlass verbindet, zu vernachlässigen. Der Innendurchmesser kann jedoch einen großen Einfluss auf die Gerätebandenverbreiterung haben [Abbildung 12].

Erwartungsgemäß nimmt die Bandenverbreiterung mit abnehmendem Innendurchmesser der Kapillare ab. Wird eine konzentrierte Analytbande in eine Kapillare mit großem Innendurchmesser geleitet, wird die Konzentration der Bande viel geringer, was zu einem breiteren, verzerrten Peak und einer verringerten Empfindlichkeit führt. Darüber hinaus führt die Reibung entlang der Kapillarwände dazu, dass sich Analytmoleküle, die mit den Kapillarwänden in Kontakt kommen, langsamer bewegen als Moleküle in der Mitte der Kapillare, was zu einem verzerrten Bandenprofil führt. Der Abstand zwischen der Mitte und den Außenkanten der Analytbande wird mit abnehmendem Innendurchmesser der Kapillare geringer. Dies reduziert die Verzerrung in der Bande. Ebenso wichtig ist es, die Länge der Kapillare zu minimieren, da übermäßige Längen eine Probenbande ebenfalls verzerren können.

Der Einfluss der Detektoreinstellungen auf die Bandenverteilung außerhalb der Säule

Zusätzlich zu den flüssigkeitsbasierten Bandenverbreiterungsbeiträgen des Geräts beeinflussen auch die digitalen Detektoreinstellungen in Bezug auf die Erfassungsgeschwindigkeit und die Filterkonstante das chromatographische Ergebnis. Dies ist besonders bei UPLC-Applikationen wichtig, da die Peakbreiten oft sehr schmal sind [1 – 2 Sekunden] und die Analysezeit sehr kurz sein kann. Beim Einstellen der Erfassungsgeschwindigkeit des Detektors sollte diese darauf basieren, dass genügend Datenpunkte über einen Peak erfasst werden, um den Peak korrekt darzustellen. Eine zu hohe Detektorrate wirkt sich negativ auf das Signal/Rausch-Verhältnis aus und führt dazu, dass das Basislinienrauschen zunimmt, ohne dass die Signalhöhe des nachzuweisenden Analyten zunimmt. Umgekehrt führt eine zu langsame Einstellung der Erfassungsrate des Detektors zu unzureichenden Datenpunkten über den Peak, wodurch die beobachtete chromatographische Effizienz verringert und die Fähigkeit zur reproduzierbaren Quantifizierung beeinträchtigt wird. Darüber hinaus wird eine Zeitkonstante [digitaler Filter] verwendet, um Datenpunkte zu glätten und so das Signal/Rausch-Verhältnis zu optimieren. Diese kann zusammen mit der Erfassungsgeschwindigkeit oder unabhängig von dieser verwendet werden.

Die Detektoreinstellungen werden mit abnehmender Breite der Analytbande immer wichtiger. Dies erfordert eine Erfassungsgeschwindigkeit, die nicht nur schnell genug ist, um einen Peak dieser Geschwindigkeit digital zu erzeugen, sondern auch, um die in der UPLC-Säule erreichte hochauflösende Trennung korrekt wiederzugeben, wenn eng eluierende Peaks vorhanden sind.

Bei langsameren Flussraten, wenn Peaks zeitlich weiter auseinander liegen, sind diese Einstellungen fehlerverzeihender. Da die Peaks jedoch schmaler werden und die Analyse schneller erfolgt [wie bei UPLC-Trennungen], müssen Erfassungsgeschwindigkeit und Zeitkonstante sorgfältig eingestellt werden [Abbildung 13]. Bei Verwendung der UPLC-Technologie für reale Applikationen ist es ratsam, die Datenerfassungsrate des Detektors [Hz] auszuwählen, die die Peakform des schmalsten Peaks genau erfasst, und dann eine Filterzeitkonstante [Sekunden] anzuwenden, die ein optimales Signal/Rausch-Verhältnis und eine optimale Auflösung für die Analyse liefert.