Manuel d’initiation à la SPE

La SPE est une chromatographie

Gardez à l’esprit que l’extraction en phase solide (SPE) repose sur les mêmes principes que la HPLC. Toute connaissance relative au comportement chromatographique des analytes d’intérêt et des autres composés de la matrice peut aider à choisir le sorbant et les éluants adéquats. Si, par exemple, vous savez que certaines conditions chromatographiques permettent une excellente séparation de votre analyte des interférences, vous pouvez choisir une combinaison similaire de sorbant et de solvant SPE. De même, si vous essayez d’éliminer une interférence qui coélue en HPLC, vous savez a priori que des conditions similaires de SPE ne fonctionneront pas.

Protocoles généraux d’élution

Il existe deux stratégies générales pour isoler et purifier les composés d’intérêt d’un échantillon :

• Vous pouvez adsorber les interférences de la matrice tandis que les composés d’intérêt passent à travers la cartouche sans être retenus.
• Vous pouvez adsorber les composés d’intérêt alors que les interférences de la matrice traversent la cartouche sans être retenues.

La première stratégie est généralement choisie lorsque le composé souhaité de l’échantillon est présent dans une concentration élevée. Lorsque les composés d’intérêt sont présents à de faibles niveaux, ou que plusieurs composés de polarités très différentes doivent être isolés, on recourt généralement à la seconde stratégie. Celle-ci permet également d’obtenir un enrichissement des composés présents à des niveaux extrêmement faibles et une concentration des échantillons dilués.

Étapes d’une procédure d’extraction en phase solide

La section suivante décrit les étapes d’une procédure complète d’extraction en phase solide. Dans de nombreuses applications, il est possible d’éviter une ou plusieurs des étapes reprises ci-dessous et décrites plus loin dans des exemples généraux, pour ainsi simplifier la procédure. Les procédures illustrées ci-après utilisent des échantillons contenant des colorants pour faciliter la visualisation des séparations. Gardez à l’esprit que la plupart des échantillons contiennent des composés incolores qui nécessitent un certain type de détecteur ou de test pour les localiser dans les fractions collectées. Tenez compte des informations suivantes lorsque vous développez votre propre procédure ou modifiez des procédures publiées dans la littérature.

1. Prétraitement de l’échantillon
2. Conditionnement de la cartouche
3. Chargement de l’échantillon
4. Élution des fractions

Chromatographie en phase normale

Ce mode est généralement utilisé pour séparer les composés organiques neutres dont la nature chimique va d’hydrophobe à moyennement polaire.

Pour effectuer une chromatographie en phase normale avec des cartouches SPE, utilisez une approche par gradient discontinu à base de solvants apolaires avec une phase stationnaire polaire.

1. Conditionnez la cartouche avec six à dix volumes de rétention de solvant apolaire, souvent le même solvant que celui dans lequel l’échantillon est dissous.
2. Chargez la solution d’échantillon sur le lit de la cartouche.
3. Éluez les composés indésirables avec un solvant apolaire.
4. Éluez le premier composé d’intérêt avec un solvant plus polaire.
5. Éluez les autres composés d’intérêt avec des solvants de plus en plus polaires (plus forts).
6. Une fois que vous avez récupéré tous vos composés, éliminez la cartouche usagée de manière sûre et appropriée.

Cette procédure est illustrée dans la figure ci-dessous pour un échantillon contenant un mélange de trois colorants organiques neutres et relativement apolaires (jaune, rouge et bleu) qui apparaît noir lorsqu’il est initialement chargé sur le lit de la cartouche.

Illustration d’un protocole général d’élution pour la chromatographie en phase normale sur cartouches SPE
(Silice, Florisil, Alumine, Diol, CN, NH₂)

Chromatographie en phase inverse

En raison de la multiplicité des échantillons aqueux couvrant un large éventail d’applications, des prélèvements d’eau dans l’environnement aux fruits et aux légumes, en passant par les boissons et les fluides biologiques, la chromatographie en phase inverse est devenue le mode prédominant de la SPE.

Pour effectuer une chromatographie en phase inverse avec des cartouches SPE, utilisez un gradient de solvants fortement à faiblement polaires (avec une force d’élution de solvant allant de faible à élevée) associé à une phase stationnaire apolaire.

1. Solvatez la phase greffée à base de silice ou le remplissage en polymère avec six à dix volumes de rétention de méthanol ou d’acétonitrile. Rincez la cartouche avec six à dix volumes de rétention d’eau ou de tampon. Ne laissez pas la cartouche sécher (sauf si vous utilisez du HLB).
2. Chargez l’échantillon dissous dans un solvant fortement polaire (faible - généralement de l’eau).
3. Éluez les composés indésirables avec un solvant fortement polaire.
4. Éluez les composés d’intérêt faiblement retenus avec un solvant moins polaire.
5. Éluez les composés plus étroitement liés avec des solvants de plus en plus apolaires (plus forts).
6. Une fois que vous avez récupéré tous les composés d’intérêt, éliminez la cartouche usagée de manière sûre et appropriée.

Cette procédure est illustrée dans la figure ci-dessous pour un échantillon d’une boisson aqueuse au raisin contenant deux colorants alimentaires polaires (rouge et bleu), ainsi que du sucre et un arôme artificiel (mais pas de vrai jus de raisin !). Une fois préparée, cette boisson présente une teinte violet clair dans un verre, car la concentration en colorant est diluée. Lorsqu’une portion est chargée sur une cartouche SPE préparée, les colorants fortement retenus se concentrent à proximité de l’entrée dans une bande violet foncé.

Illustration d’un protocole général d’élution pour la chromatographie en phase inverse sur cartouches SPE
(C₁₈, tC₁₈, C₈, CN, Diol, HLB, Porapak RDX, NH₂)

Chromatographie par échange d’ions

Il est souvent préférable d’isoler les composés ioniques ou ionisables en utilisant une certaine forme de chromatographie par échange d’ions. Ce mode de séparation est complémentaire aux modes en phase normale et en phase inverse plus courants et offre une seconde dimension sélective puissante aux protocoles de préparation des échantillons.

Illustration des deux principaux types de phases, à savoir l’échange d’anions et de cations, et de la façon dont elles attirent et retiennent de manière sélective les molécules de charge opposée

Pour effectuer une chromatographie par échange d’ions avec des cartouches SPE, utilisez un gradient de pH ou de force ionique avec une phase stationnaire échangeuse d’ions.

1. Conditionnez la cartouche avec six à dix volumes de rétention d’eau déionisée ou de tampon faible.
2. Chargez l’échantillon dissous dans une solution d’eau déionisée ou de tampon.
3. Éluez les composés faiblement liés indésirables avec un tampon faible.
4. Éluez le premier composé d’intérêt avec un tampon plus fort (modifiez le pH ou la force ionique).
5. Éluez les autres composés avec des tampons de plus en plus forts.
6. Une fois que vous avez récupéré tous vos composés, éliminez la cartouche usagée de manière appropriée.

Cette procédure est illustrée dans la figure ci-dessous pour un échantillon d’un mélange aqueux de deux colorants ioniques présentant des valeurs pK_a différentes. Lorsqu’ils sont chargés sur la cartouche, les deux colorants sont fortement retenus et la combinaison des composés bleu et jaune apparaît sous la forme d’une bande verte près de l’entrée.

Illustration du protocole général d’élution pour la chromatographie par échange d’ions sur cartouches SPE
(NH₂, Accell™ Plus QMA, Accell Plus CM, SCX, SAX, WCX, WAX)

Les échangeurs de cations et d’anions sont ensuite classés en échangeurs faibles ou forts, en fonction du type de groupe ionique à leur surface. Les échangeurs de cations forts possèdent un groupement de surface acide, tel qu’un acide sulfonique qui est toujours ionisé (chargé négativement) sur toute la plage de pH. Les échangeurs de cations faibles possèdent un groupement de surface acide, par exemple un acide carboxylique qui est chargé négativement à pH élevé, mais neutre à pH faible. De même, les échangeurs d’anions forts portent généralement des groupements d’ammonium quaternaire toujours chargés positivement, tandis que les échangeurs d’anions faibles possèdent des groupements d’amines primaires, secondaires ou tertiaires qui peuvent être chargés positivement à pH faible, mais neutres à pH élevé.

Utilisez le tableau suivant pour choisir le type de cartouche SPE échangeuse d’ions adaptée à votre analyte.

La chromatographie par échange d’ions en mode mixte combine l’utilisation des modes d’échange d’ions et en phase inverse en un seul protocole sur une seule cartouche SPE. Elle peut être utilisée pour isoler et séparer les composés neutres, acides et basiques d’une matrice complexe unique. Un substrat de sorbant idéal pour une SPE en mode mixte reste mouillable à l’eau tout en présentant une forte rétention des composés hydrophobes en phase inverse. Sa surface comporte des fonctionnalités d’échange d’ions de l’un des quatre types généraux décrits ci-dessus. Il est possible de recourir à des lavages intermédiaires avec des mélanges de solvants organiques de force d’élution appropriée pour isoler les composés neutres (y compris les analytes ionisables à l’état neutre). L’élution sélective des analytes liés par voie ionique peut être obtenue en manipulant la charge de l’analyte (lorsqu’il est lié à des échangeurs d’ions forts) ou du sorbant (pour les analytes liés à des échangeurs d’ions faibles).