Química básica para GPC

Introdução à separação por tamanho

A cromatografia de permeação em gel (GPC, Gel Permeation Chromatography), também conhecida como cromatografia de exclusão por tamanho, (SEC, Size Exclusion Chromatography) é realmente a mais fácil de entender de todas as técnicas cromatográficas líquidas. A separação é baseada estritamente no tamanho da amostra na solução e não deve haver interação com o preenchimento da coluna (adsorção, partição, etc.), como acontece com a HPLC convencional. O modo de separação não é baseado no peso molecular, mas no tamanho do material que está sendo analisado (geralmente um polímero) em solução. Em outras palavras, para fazer a GPC corretamente, a amostra deve ser dissolvida em um solvente adequado.

A concentração da amostra na solução depende do peso molecular, mas é normal haver uma concentração de 0,10% (p/v) para um polímero de peso molecular de aprox. 100000. (Veja mais na seção "Preparo de amostras" abaixo). Às vezes, a solução da amostra deve ser aquecida para dissolver a amostra. Por exemplo, algumas poliolefinas precisam de temperaturas superiores a 120 °C para se dissolverem e são normalmente executadas em 1,2,4 triclorobenzeno a 140 °C.

Uma vez que a amostra tenha sido adequadamente dissolvida, ela é introduzida por meio de um mecanismo de injeção em um conjunto de colunas que atuam como um sistema de filtração molecular. As colunas são preenchidas com um gel reticulado (copolímero de estireno/divinilbenzeno para aplicações orgânicas, por exemplo), que contém poros de superfície. Esses poros podem variar de pequenos a bem grandes e atuam como os filtros moleculares mencionados acima. As moléculas de tamanho maior não caberão nos poros menores. Por outro lado, as moléculas menores caberão na maioria dos poros e serão retidas por mais tempo.

Uma das primeiras demonstrações de GPC realizadas pela Waters décadas atrás foi com goma de mascar. A goma de mascar é, na verdade, borracha sintética e aditivos, como sabores, estabilizadores, etc.

Aqui está uma representação do cromatograma de GPC original, separado em várias colunas de vários tamanhos de poros conectadas em série. O polímero (borracha, nesse caso) elui primeiro porque é a maior molécula, seguido pelos "aditivos" em ordem decrescente de tamanho. Isso também poderia ser um cromatograma de PVC com uma mistura de plastificantes, antioxidantes e estabilizadores de UV.

Distribuições de monômeros, oligômeros, polímeros e peso molecular

Os monômeros têm um único peso molecular e são considerados monodispersos. Os exemplos seriam etileno, estireno, cloreto de vinila, etc. Depois dos monômeros, temos dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros, etc., que são chamados de oligômeros. À medida que chegamos a pesos moleculares mais altos, o grupo é chamado de polímeros. Os polímeros têm uma distribuição de comprimentos de cadeia e, portanto, pesos moleculares. Dependendo de como a polimerização foi realizada, essa distribuição pode ser estreita ou bastante ampla. Como exemplo, um polímero de condensação ou de crescimento em etapas, como um poliéster, (tereftalato de polietileno), terá uma distribuição bastante estreita de pesos moleculares. Por outro lado, uma polimerização de radicais livres pode produzir um polímero com uma distribuição muito ampla de comprimentos de cadeia e pesos moleculares (como para as poliolefinas). O controle da cinética da polimerização é extremamente importante na obtenção de uma distribuição de peso molecular desejada. É por isso que a GPC é uma técnica tão importante para o químico de polímeros.

Aqui, mostramos uma sobreposição de duas distribuições de peso molecular de um polímero (neste caso, poliestireno):

Depois de obter a distribuição do peso molecular da amostra de polímero, precisamos de uma forma de quantificá-la. Atribuímos médias de peso molecular nesta distribuição simplesmente fazendo estatísticas. Há uma altura (Hi, também representada como concentração, Ci), um tempo de retenção e um peso molecular (Mi), atribuídos a cada corte. O peso molecular é obtido a partir de uma curva de calibração (consulte a próxima seção). Em seguida, realizamos um somatório para obter as várias médias de peso molecular que descrevem a distribuição de peso molecular do polímero. O PD mostrado é a razão dos pesos moleculares médio ponderal e de média numérica e é chamada de polidispersão ou, às vezes, simplesmente de dispersão do polímero. Esse somatório é apenas uma maneira simples de obter esses quatro momentos estatísticos de peso molecular e descrever a distribuição desse peso.

Existem outras técnicas para obter essas médias de peso molecular:

• A média numérica, Mn, pode ser obtida por osmometria de membrana ou análise de grupo final (titulação, NMR, etc.)
• A média ponderal, Mw, pode ser obtida por espalhamento de luz
• A Média Z, Mz, e a Média Z + 1, Mz + 1, podem ser obtidas por ultracentrifugação

Depois de calibrar nosso sistema GPC, podemos obter todas essas médias com uma injeção única.

Configuração de um sistema GPC

Agora que entendemos o que significam as médias de peso molecular, estamos prontos para montar um sistema.

O sistema (mostrado acima) consiste em uma bomba, um injetor de algum tipo, manual ou automatizado, o conjunto de colunas, o(s) detector(es) e algum tipo de dispositivo de manuseio de dados. Além disso, é uma boa ideia empregar um desgaseificador, especialmente ao utilizar THF com um detector de índice de refração. As colunas são quase sempre aquecidas a alguma temperatura elevada, mesmo para aplicações solúveis em temperatura ambiente, para garantir baixa queda de pressão e viscosidades uniformes. Agora, abordaremos o sistema com mais detalhes.

Gerenciamento de solvente

As bombas que estão sendo utilizadas atualmente com os sistemas GPC da Waters são dispositivos de manuseio de fluidos realmente sofisticados. No caso do sistema de fluidos que está sendo utilizado no Sistema Alliance, é realmente um gerenciador de solvente. O fator mais importante a ser considerado ao escolher um módulo de fluidos para análise de GPC é a precisão do fluxo. A calibração do sistema é um gráfico do tempo de retenção (ou volume) versus o log do peso molecular. Qualquer pequena flutuação de fluxo resultará em um erro potencialmente grande no peso molecular. É recomendável utilizar o dispositivo de manuseio de fluidos mais preciso possível. Isso melhorará imensamente a precisão das medições da média de peso molecular em comparação com algumas das bombas tradicionais de baixa precisão de fluxo que ainda estão sendo utilizadas. Com o gerenciador de solvente que é utilizado com o Sistema Alliance, a precisão do fluxo é notavelmente abaixo de 0,075% sem nenhuma correção da taxa de fluxo! Algumas bombas no mercado afirmam uma precisão de fluxo semelhante, mas com correção de taxa de fluxo por software. Fique atento a bombas vendidas no mercado que listam uma especificação de 0,3% (e pior) se estiver montando um sistema GPC.

O gerenciador de solvente do Sistema Alliance também fornece um desempenho excepcional do programa de gradiente e fluxo. Muitos químicos de caracterização de polímeros estão percebendo a importância de analisar o pacote de aditivos, além de determinar a distribuição do peso molecular do polímero. Em muitos casos, o pacote de aditivos tem tanto a ver com a aplicação bem-sucedida de um produto acabado quanto com o polímero utilizado para fabricar o produto. Quaisquer erros na composição (por exemplo, antioxidante incorreto ou nível incorreto de plastificante) dos aditivos na formulação principal podem resultar em propriedades físicas e desempenho inaceitáveis. Para caracterizar com êxito o pacote de aditivos, é realizada uma análise por HPLC por gradiente de fase reversa. Além dos aditivos de polímero, as resinas epóxi e fenólicas são analisadas regularmente por GPC (para examinar a distribuição do oligômero) e por HPLC por gradiente (para caracterizar o isômero e as impurezas). O Sistema Alliance permite fazer análises por gradiente e GPC de alto desempenho com um único sistema.

Gerenciamento de amostras

A próxima etapa na configuração de nosso sistema é decidir como desejamos introduzir os padrões e as amostras para a separação. A maneira mais econômica de fazer isso é com um injetor manual. Você preenche manualmente um loop (volume conhecido) e abre uma válvula para permitir que a solução flua para a coluna definida com o fluxo de eluente. Isso funcionará se você estiver executando apenas algumas amostras de vez em quando. No entanto, se estiver executando várias amostras por dia, poderá ser melhor considerar um amostrador automático.

O amostrador automático mais utilizado atualmente para análise de GPC em temperatura ambiente é o Amostrador automático 2707. Esse amostrador automático totalmente elétrico permitirá configurar uma bandeja cheia de amostras para ser executada sem supervisão pelo tempo que as análises durarem. A exatidão e a reprodutibilidade do volume de injeção são insuperáveis, o que é fundamental para medições de massa do detector sensível ao peso molecular (como com um viscosímetro ou detector de espalhamento de luz), em que o carregamento de massa exata deve ser conhecido. Outra opção de amostrador automático é o Sistema Alliance. Existem cinco carrosséis diferentes, cada um contendo até 24 amostras (capacidade total de 120 amostras).

Seleção de coluna

Depois de encontrar um solvente adequado para dissolver o polímero e preparar nossos padrões estreitos e amostras na concentração correta, estamos prontos para iniciar nossa análise. Escolhemos o conjunto de colunas correto para fazer a análise (ou não?), então estamos prontos para prosseguir. No entanto, vamos revisar o procedimento para escolher o conjunto de colunas correto.

Muitas pessoas gostam de utilizar o que costumava ser chamado de colunas "Lineares", que também são chamadas de colunas de "Intervalo estendido" ou "Leito misto". Essas colunas são misturas de tamanhos de poros diferentes, a ideia é cobrir uma faixa mais ampla de peso molecular do que uma coluna com um único tamanho de poro. Se a mistura de poros for feita com cuidado suficiente, a curva de calibração da coluna pode, de fato, ser linear.

A desvantagem de utilizar essas colunas de leito misto é que você terá menos resolução em um intervalo molecular finito do que se fossem utilizadas colunas de tamanho de poro individuais. Por exemplo, se estivesse executando uma série de resinas epóxi ou fenólicas, digamos, com um intervalo de peso molecular de algumas centenas a cinco mil, que conjunto de colunas utilizaria? A primeira consideração é ter volume de poros suficiente no conjunto de colunas para obter a separação correta, ou seja, o perfil de distribuição correto do polímero. Certamente, uma coluna não é suficiente, e duas ainda podem não ser suficientes. Deve-se utilizar pelo menos três colunas em série para assegurar que tenhamos volume de poros suficiente para garantir uma separação bem-sucedida.

Agora, quais colunas utilizaremos para analisar nossa resina epóxi ou fenólica? Devemos utilizar um conjunto de colunas de "leito misto", com uma mistura de tamanhos de poros? Ou deveríamos utilizar uma série de colunas de tamanho de poro individuais para realmente visar ao intervalo de peso molecular de interesse? A tabela a seguir lista o intervalo de separação de peso molecular para colunas de tamanhos de poros individuais de preenchimentos de estireno/divinilbenzeno, com base nos limites de exclusão de comprimento de cadeia de poliestireno (em Angstroms):

Só mais uma consideração sobre colunas. Se você consultou o guia de solvente de GPC, notou que um intervalo operacional típico de temperaturas foi mostrado. Na análise por GPC, quase sempre aquecemos as colunas a alguma temperatura elevada, conforme mostrado no guia de solvente, (mesmo para aplicações em temperatura ambiente). O propósito de aquecer as colunas não é para fins de dissolução, mas para aumentar a resolução da separação, melhorar o processo de permeação e, em alguns casos, diminuir a viscosidade do solvente (DMF, por exemplo) e reduzir a contrapressão através do banco de colunas. 

Opções de detector

O detector mais utilizado atualmente para análise por GPC é o refratômetro diferencial. É um detector sensível à concentração que mede simplesmente a diferença no índice de refração (dRI) entre o eluente no lado de referência e a amostra + eluente no lado da amostra. É um detector "universal" (ao contrário de um detector UV, por exemplo) no qual será obtida uma resposta para qualquer polímero que tenha uma diferença significativa no índice de refração em comparação com o eluente. Em alguns casos, o dRI da amostra e do eluente (silicones e THF, por exemplo) é muito pequeno, resultando em um sinal fraco. Nesse caso, precisamos encontrar outro eluente que dissolva o polímero e forneça um dRI significativo. Há muitos anos, o Refratômetro Waters 2414 (e os modelos anteriores 2410 e 410) é o padrão da indústria.

Outro detector que é utilizado com frequência para GPC é o detector UV. Obviamente, precisamos ter algum cromóforo presente que será absorvido no UV para obter um sinal. O detector UV é excelente para polímeros do tipo estireno (poliestireno, estireno/isopreno, estireno/butadieno, ABS, etc.), epóxis, fenólicos, policarbonatos, poliuretanos e poliésteres aromáticos, por exemplo. Se a análise por gradiente estiver sendo realizada (a composição do solvente está sendo alterada ao longo da corrida), o detector UV deverá ser utilizado, pois o detector RI continuará a se deslocar conforme a composição do eluente muda. O Detector UV Waters 2489 fornece excelente sensibilidade, linearidade e extraordinário desempenho geral para análise por GPC/HPLC de polímeros e aditivos que absorvem UV.  

Também podemos utilizar um detector de arranjo de fotodiodos (PDA, Photodiode Array), que é um nível acima do UV, além de ser um detector eficiente e rico em informações. Um arranjo de fotodiodos é utilizado nesse detector, em que podemos observar uma grande variedade de comprimentos de onda instantaneamente. Por exemplo, poderíamos configurar o PDA para analisar um intervalo de comprimento de onda de 190 a 800 nanômetros (nm), em vez de analisar apenas um ou dois comprimentos de onda como para a maioria dos detectores UV. Agora, podemos analisar os espectros de UV reais para a amostra de polímero (ou aditivos). Isso nos permite determinar algo sobre a distribuição da composição química. Podemos determinar se uma SBR (borracha de estireno/butadieno, Styrene/Butadiene Rubber) é um copolímero em bloco ou aleatório, por exemplo. Podemos criar bibliotecas espectrais, com as quais podemos comparar nossas amostras desconhecidas. Isso pode ser feito para polímeros ou com aditivos de polímero. Agora podemos tentar identificar quais aditivos estão presentes em materiais compostos e acabados. O PDA também pode ser utilizado para ajudar a deformular compostos competitivos.  

Como os químicos de caracterização de polímeros se esforçam para aprender o máximo possível sobre suas amostras, outras opções de detecção são consideradas. À medida que avançamos para o mundo da detecção "avançada" para análise por GPC, começamos a considerar os detectores sensíveis ao peso molecular, como viscosimetria e espalhamento de luz. O detector de viscosímetro será abordado com alguns detalhes na seção de calibração que se segue. Basicamente, colocar um detector de viscosímetro em linha com o refratômetro fornece uma maneira de obter não apenas a viscosidade intrínseca (h) do polímero, mas também o peso molecular "absoluto" e a estimativa da ramificação de cadeia longa. O detector RI é o nosso detector de concentração, (C), e o viscosímetro fornece (h)(C). Utilizar os dois sinais em tandem fornecerá a viscosidade intrínseca em cada corte ao longo do perfil de eluição do polímero. Podemos então usar os conceitos de calibração universal de Benoit abordados na próxima seção para obter o peso molecular absoluto da amostra de polímero.  

O detector de espalhamento de luz, juntamente com o refratômetro, é outro modo poderoso de detecção avançada para análise por GPC. Basicamente, um feixe de laser é focalizado em uma célula (on-line, neste caso) que contém a solução de amostra. O feixe incidente será espalhado pelas partículas de polímero que estão em solução. Dependendo do modelo do detector de espalhamento de luz (ângulo pequeno ou vários ângulos), o peso molecular médio ponderal, Mw, pode ser medido de modo preciso com ou sem o resultado do raio de rotação do polímero em solução.  

Em ambos os casos, do viscosímetro e do detector de espalhamento de luz em tandem com o RI, obtemos várias informações muito úteis. Utilizar uma abordagem de detector triplo fornece dados muito significativos, desde que o usuário seja capaz de interpretá-los. Para uma discussão mais detalhada sobre a redução de dados de vários detectores, consulte nossa seção de referência.  

Existem outras técnicas para detecção avançada de polímeros e aditivos, como Espectrometria de Massas, mas os detectores comuns utilizados atualmente para análise por GPC são o RI, UV/PDA, viscosímetro e espalhamento de luz.

Manuseio de dados

Uma vez que tenhamos configurado a parte principal do hardware de nosso sistema, devemos agora considerar as opções de software para controle desse sistema e processamento dos dados. Com os computadores muito avançados de hoje, os cálculos de calibração e de distribuição de peso molecular podem ser feitos em segundos. O software Empower pode ser utilizado para redução convencional de dados por GPC (somente RI), bem como para detecção de RI/viscosimetria. O Empower 2 é compatível com muitos procedimentos de calibração, incluindo calibração relativa, correspondência cumulativa e calibração de padrões amplos de Hamielec, e calibração universal. Ajustes de curva de zero a quinta ordem, juntamente com uma calibração limitada exclusiva e um ajuste por spline, são todos compatíveis.