Guia para iniciantes em cromatografia de exclusão por tamanho

Para atribuir um peso molecular a cada corte de tempo de retenção para o polímero eluído, devemos calibrar nosso sistema, ou mais especificamente, o conjunto de colunas. Existem várias maneiras de fazer isso, porém, a mais fácil é utilizar uma calibração relativa com base em um conjunto de padrões de polímeros bem caracterizados com a distribuição de peso molecular mais estreita possível. Idealmente, gostaríamos de utilizar um conjunto de padrões que são monodispersos, ou seja, um único peso molecular, com a razão média numérica e ponderal (dispersão) sendo igual a um, (Mw/Mn = 1).

O mais perto que podemos chegar de conseguir isso é utilizar padrões de polímeros que são polimerizados especificamente para essa finalidade, como os padrões estreitos de poliestireno polimerizado anionicamente. Os padrões cobrem um intervalo de peso molecular muito amplo, de monômero a pesos moleculares > 10000000, com uma dispersão < 1,10. Para que um padrão de calibração seja realmente considerado estreito e aceitável para utilização em calibração de GPC, a dispersão deve realmente ser < 1,10. Também há maneiras de fazer uma calibração de padrões amplos, e o procedimento de calibração universal de Benoit (com ou sem um viscosímetro on-line) também pode ser utilizado. Abordaremos cada um deles com alguns detalhes:

Calibração relativa de padrão estreito

Chamamos a técnica de calibração convencional de padrão estreito uma calibração relativa porque as médias de peso molecular obtidas são relativas ao calibrador. Por exemplo, se o polietileno estivesse sendo executado como amostra e o conjunto de colunas fosse calibrado com padrões estreitos de poliestireno, os pesos moleculares obtidos após a integração seriam baseados em poliestireno e seriam incorretos para polietileno. No entanto, isso é bom para muitas pessoas que estão simplesmente comparando os pesos moleculares obtidos para um desconhecido em relação a um conjunto de valores "aceitáveis". Se esses valores de peso molecular são realmente "absolutos" ou não para seu polímero de interesse não importa desde que esses valores obtidos estejam no intervalo aceitável.

Existem alguns outros padrões estreitos disponíveis para GPC orgânica, como poli(metilmetacrilatos), poli-isoprenos, polibutadienos, poli(THF), mas certamente o poliestireno é o principal padrão estreito utilizado para análise por GPC orgânica. No caso da GPC aquosa, os poli(óxidos de etileno) são os mais utilizados, juntamente com os poli(etilenoglicóis) para baixo peso molecular e os pululanos, que são polissacarídeos baseados em estruturas triose. Após executar a série de padrões estreitos, um ajuste polinomial é feito, (normalmente de terceira ou quinta ordem), e o log M resultante versus a curva de calibração de tempo de retenção (ou volume) serão representados em gráfico.

Calibração de padrões amplos

Também é possível calibrar o conjunto de colunas de GPC utilizando um padrão amplo que seja o mesmo polímero executado como o desconhecido. O padrão amplo pode ser adquirido de vários fornecedores diferentes, e o padrão deve ser bem caracterizado, isto é, o número, peso, pesos moleculares médios de Z e possivelmente viscosidade devem ter sido determinados por métodos alternativos, (osmometria de membrana, espalhamento de luz, ultracentrifugação, por exemplo). Um método alternativo seria utilizar uma "amostra" real do material (presente em uma quantidade significativa), em que as médias de peso molecular foram determinadas por essas outras técnicas. A vantagem disso é poder utilizar um polímero que tenha a mesma estrutura das amostras desconhecidas que estão sendo analisadas diariamente.

As médias de peso molecular conhecidas são inseridas no software, e o padrão amplo é cromatografado da maneira usual, sob as mesmas condições em que os desconhecidos serão cromatografados. O software realiza uma rotina de pesquisa pelo método Simplex, ajustando a forma do padrão amplo cromatografado para as médias de peso molecular fornecidas. A curva de calibração resultante consistirá nos pontos de dados para cada média. Se apenas uma média numérica e ponderal for fornecida, a curva de calibração resultante consistirá nesses dois pontos mais o peso molecular do pico, ou uma curva de calibração de três pontos. Esse padrão amplo é baseado no trabalho realizado por Hamielec em 1969. Recomenda-se que dois padrões amplos de pesos moleculares diferentes sejam utilizados para aumentar o intervalo de peso molecular da curva de calibração Mesmo quando dois padrões largos são utilizados com duas médias de peso molecular conhecidas, somente uma curva de calibração de seis pontos é obtida (utilizando valores de peso molecular do pico pelo resultado da rotina de pesquisa). Entretanto, para o laboratório de CQ que executa o mesmo polímero todos os dias, no mesmo intervalo de peso molecular dos padrões amplos, esta calibração funciona muito bem e fornece pesos moleculares absolutos.

Existem alguns outros padrões estreitos disponíveis para GPC orgânica, como poli(metilmetacrilatos), poli-isoprenos, polibutadienos, poli(THF), mas certamente o poliestireno é o principal padrão estreito utilizado para análise por GPC orgânica. No caso da GPC aquosa, os poli(óxidos de etileno) são os mais utilizados, juntamente com os poli(etilenoglicóis) para baixo peso molecular e os pululanos, que são polissacarídeos baseados em estruturas triose. Após executar a série de padrões estreitos, um ajuste polinomial é feito, (normalmente de terceira ou quinta ordem), e o log M resultante versus a curva de calibração de tempo de retenção (ou volume) serão representados em gráfico.

Calibração universal

O conceito de calibração universal foi introduzido por Benoit, et. al. em 1967. Em vez de representar graficamente o log do peso molecular de uma série de padrões estreitos versus retenção, o log do produto da viscosidade intrínseca (η) e do peso molecular M é representado em gráfico versus retenção. O produto (η)M é relatado para o volume hidrodinâmico. Benoit descobriu que a representação em gráfico de uma série de valores de volume hidrodinâmico para uma variedade de padrões estreitos resultava em uma curva de calibração singular. Em outras palavras, todos os pontos se encaixavam na mesma curva. Quando essa calibração "universal" for estabelecida, qualquer polímero espiralado aleatório poderá ser executado no solvente apropriado e o peso molecular determinado baseado na curva universal. Benoit utilizou um viscosímetro capilar de vidro para medir as viscosidades das amostras e dos padrões estreitos. Após estabelecer a curva universal, também podemos representar em gráfico o log da viscosidade intrínseca versus o log do peso molecular para os padrões estreitos. O nome desse gráfico é Lei da Viscosidade ou gráfico de Mark-Houwink. A inclinação desse gráfico é alfa (às vezes chamada de α), e a interceptação é chamada de log K. A equação resultante, conhecida como equação de Mark-Houwink, é:

O Polymer Handbook contém muitos valores de K e alfa para várias combinações diferentes de polímero/solvente. É possível inserir essas constantes empíricas em muitos dos pacotes de software de GPC disponíveis atualmente no mercado e obter pesos moleculares "absolutos" ou acurados de muitos polímeros. Certifique-se de que os valores no manual sejam acurados para o polímero a ser analisado ou, do contrário, ocorrerão erros. 

Atualmente, podemos utilizar um detector de viscosímetro on-line, juntamente com o detector de índice de refração diferencial (dRI, Differential Refractive Index), para obter diretamente o peso molecular de cada corte. O dRI é o detector de concentração (C), e o detector de viscosímetro fornece o produto da viscosidade intrínseca e da concentração ([η]C). A divisão do sinal do viscosímetro pelo sinal de dRI fornece a viscosidade intrínseca (n i) de cada corte através do pico do polímero. Agora, sabemos a viscosidade intrínseca e, é claro, o tempo de retenção (ou volume) de cada corte, para que possamos voltar à curva de calibração universal e obter o peso molecular de cada corte, Mi. Esse conceito de calibração universal tem ampla aplicabilidade, especialmente para polímeros do tipo bobina aleatória, que representa a maioria dos polímeros que estão sendo analisados atualmente. Outras conformações de polímero, como hastes, esferas ou formas globulares (como proteínas), podem não se comportar nos conceitos universais. Não pode haver interação do polímero e do eluente ou do material de retenção da coluna para que a calibração universal funcione.  

Outra vantagem de utilizar a calibração universal e a detecção de viscosimetria/dRI on-line é a capacidade de determinar se um polímero é ramificado, em relação a um padrão de polímero linear conhecido. Essa técnica é muito sensível à ramificação de cadeia longa (em oposição à ramificação de cadeia curta) e é importante para ajudar a prever como um determinado polímero será processado, ou quais serão as propriedades físicas finais, em comparação com a contraparte linear. 

Como exemplo, pode-se executar um polímero largo de polietileno linear (como "NBS 1475" ou qualquer outro polietileno linear conhecido), com os valores de Mark-Houwink resultantes sendo determinados a partir do experimento. O gráfico de Mark-Houwink resultante (ou gráfico da lei da viscosidade) será linear, com uma inclinação constante (alfa será constante ao longo da distribuição de peso molecular). Os valores de K e alfa podem ser inseridos no software, e quaisquer polietilenos desconhecidos subsequentes podem ser analisados, com o gráfico da lei da viscosidade sendo comparado ao do polietileno linear conhecido.

Se o desconhecido exibir qualquer ramificação de cadeia longa, a relação viscosidade/peso molecular não será linear; ou seja, a viscosidade não aumentará linearmente com o peso molecular. Quanto maior for o desvio da linearidade, maior será o nível de ramificação de cadeia longa. Um alfa acurado pode ser obtido para um polímero ramificado apenas em pesos moleculares baixos, em que não há ramificação de cadeia longa, e a inclinação é constante. Uma vez que o polímero está em um peso molecular em que há ramificação de cadeia longa, o alfa muda continuamente (pode até se aproximar de zero) e se torna sem sentido. Uma razão simples do gráfico da lei da viscosidade do polímero ramificado para o polímero linear fornece o índice de ramificação, (g'), em que: g' = (η)br/(η)lin. É possível fazer cálculos adicionais para determinar a frequência de ramificação, que tipo de ramificação está presente, etc. É óbvio que adicionar um detector de viscosímetro on-line com um detector de índice de refração pode fornecer muito mais informações sobre seu polímero, especificamente:

• Pesos moleculares "absolutos" ou acurados para seus polímeros por meio da calibração universal.
• Cálculo da viscosidade intrínseca de seu polímero
• Determinação da ramificação

Realização de uma análise por GPC

O critério mais importante no preparo para fazer uma análise por GPC é encontrar um solvente adequado para dissolver o polímero. Isso parece trivial, mas lembre-se de que a GPC é uma técnica de separação baseada no tamanho do polímero em solução. As cadeias de polímeros se abrirão até uma determinada conformação relaxada em solução, e o solvente escolhido determinará qual será esse tamanho. Muitos polímeros são solúveis em temperatura ambiente em vários solventes, mas, em alguns casos, (especialmente para polímeros altamente cristalinos), alta temperatura é necessária para a dissolução. Outro aspecto importante para o preparo de amostras por GPC é a concentração escolhida. Se o carregamento de massa da amostra no conjunto de colunas for muito alto, poderá haver efeitos de concentração ou viscosidade, o que dará origem a volumes de eluição incorretos. Outra consideração é se a solução de polímero deve ser filtrada ou não. Abordaremos algumas dessas considerações sobre o preparo de amostras.

Observe que, em muitos casos em que o nitrato de sódio é mostrado, muitos trabalhadores utilizaram acetato, sulfato, cloreto de sódio, etc. Recomendamos nitrato de sódio, que demonstrou minimizar interferências iônicas de forma muito consistente para compostos neutros e aniônicos. A razão para esses vários eluentes é a carga aniônica geral do material de retenção. O preenchimento de gel à base de metacrilato para GPC aquosa tem uma carga aniônica geral, que pode causar exclusão de íons para amostras aniônicas e adsorção de íons para amostras catiônicas se executado apenas em água. 

O eluente deve ser sempre filtrado sob vácuo antes da utilização no sistema cromatográfico. Com os solventes orgânicos, geralmente um filtro de fluorocarbono é utilizado. O tamanho da membrana do poro do filtro é geralmente de 0,45 μm (mícron). Para GPC aquosa (filtração da água), um tipo de filtro de membrana de acetato é utilizado. Se estiver se preparando para fazer uma análise por espalhamento de luz, será recomendado filtrar o eluente através de um filtro de 0,20 μm. Alguns solventes orgânicos, como o DMF, são muito viscosos e não umedecem muito bem a superfície do filtro de fluorocarbono. Uma boa dica é umedecer a superfície do filtro inicialmente com metanol e, em seguida, iniciar rapidamente a filtração de DMF. Em seguida, descarte esse pequeno volume de mistura de metanol/DMF e, em seguida, inicie a filtração de DMF antes que o filtro seque.

Concentração

Depois de escolher o solvente adequado para a análise, a próxima etapa é preparar o padrão estreito e as soluções de amostra. Precisamos ter o cuidado de utilizar concentração suficiente para ser capaz de obter um sinal-ruído aceitável, mas sem risco de sobrecarregar a coluna e arriscar os efeitos da concentração. A tabela abaixo é uma "regra geral" a ser utilizada como um guia sobre qual concentração deve ser preparada. Essas concentrações estão em porcentagem, em que 1,0 mg/mL é 0,10%. Nenhuma correção é feita para a temperatura, então, presume-se que tudo esteja preparado em temperatura ambiente. Lembre-se de que, se a viscosimetria ou análise de espalhamento de luz estiver sendo realizada, a massa exata injetada precisará ser determinada. Isso exigirá correções de densidade se a análise estiver sendo feita em temperatura elevada. Essas concentrações mostradas devem ser utilizadas presumindo um volume máximo de injeção de 100 uL por coluna. 

Preparo das amostras

Agora que dissolvemos com êxito os padrões e as amostras no solvente escolhido e instalamos nossas colunas de GPC, estamos prontos para começar a fazer injeções. A próxima escolha que temos que fazer é se devemos ou não filtrar a solução de amostra. Em quase todos os casos, devemos filtrar a solução da amostra antes da injeção.  

Geralmente, como no caso da filtração de solvente discutida anteriormente, escolheríamos um filtro de fluorocarbono de membrana de 0,45 μm. Em alguns casos, em que há material particulado muito fino (como negro de carvão, dióxido de titânio, sílica ou outros enchimentos), um filtro de 0,20 μm pode ser utilizado.  

Obviamente, quando começamos a utilizar tamanhos de filtro muito finos, a deformação do polímero pode se tornar uma preocupação. A filtração de um polímero de alto peso molecular através de um filtro de 0,20 μm certamente causaria alguma degradação por deformação. Talvez seja necessário optar por não filtrar a amostra e esperar que não haja aumento de pressão devido ao entupimento do filtro em linha do sistema ou do frit da coluna.  

Agora podemos começar a fazer injeções dos padrões e das amostras. Conforme mencionado anteriormente, injetaremos no máximo 100 μL por coluna, nas concentrações mostradas na tabela. Nosso tempo de corrida será de aproximadamente 15 minutos por coluna a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min, de modo que o tempo de análise para um conjunto de três colunas seria de aprox. 45 min.  

Depois que o conjunto de amostras tiver sido executado, será hora de o sistema de manuseio de dados processar os resultados de acordo com o método de integração designado e fornecer um relatório completo. Isso pode ser feito automaticamente no modo "Run and Report" (Executar e reportar) no software Empower, ou podemos escolher acessar cada arquivo de dados brutos e integrar manualmente cada amostra.