Diagnostic des problèmes de forme de pics en HPLC

La modification de la forme des pics est un problème courant lors des analyses HPLC. Dans l’idéal, les pics doivent être symétriques et décrire une courbe gaussienne [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), p. 353–362]. La symétrie d’un pic peut être mesurée en calculant le facteur de traînée USP (T), comme illustré en figure 1. Un facteur de traînée de 1 indique une symétrie parfaite. Les valeurs inférieures à 1 dénotent un front diffus et les valeurs supérieures à 1 une traînée. De nombreuses méthodes imposent que tous les pics aient un facteur de traînée inférieur à une limite donnée. Des facteurs de traînée plus élevés peuvent diminuer la résolution des pics à élution proche et rendre l’intégration plus difficile [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), p. 353–362].

Lorsque l’on analyse un lot d’échantillons à l’aide d’une méthode éprouvée, il arrive que la forme des pics change au cours d’une série d’injections, parfois jusqu’au point où les critères des facteurs de traînée ne sont plus satisfaits. Plusieurs causes peuvent expliquer ces changements, notamment des problèmes liés au système HPLC, à la phase mobile, à l’échantillon et à la colonne [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Scsience+Business Media, New York, 1989, p. 385–420]. Un bon point de départ pour le diagnostic est de se pencher attentivement sur les chromatogrammes pour voir si tous les pics sont concernés ou seulement certains d’entre eux. Dans le deuxième cas de figure, considérez les propriétés des analytes dont les pics ont changé et déterminez en quoi elles diffèrent de celles des autres analytes. Les composés qui posent problème sont-ils basiques ou acides, alors que les autres ne le sont pas ? Dans ce cas, le phénomène peut être dû à une modification de la charge de surface de la phase stationnaire ou à une variation du pH de la phase mobile. Si, dans une méthode en phase inverse, les analytes qui présentent une déformation des pics sont basiques alors que les autres ne le sont pas, on peut suspecter la perte des groupes de recouvrement terminal (endcapping) de la phase stationnaire, entraînant une augmentation de la concentration des groupements silanols. L’ionisation de groupements silanol sur le substrat constitue une cause fréquente de traînée des pics pour les composés basiques [D. V. McCalley, Chem. Comm. 59 (2023), p. 7887–7899].

Si tous les pics d’un chromatogramme présentent des changements de forme similaires, l’une des causes possibles est le glissement de la tubulure reliant la colonne au système HPLC. Ce problème peut se produire lors de l’utilisation de raccords PEEK à serrage manuel. Une autre cause possible est la présence d’un vide dans la colonne, qui peut se former lorsqu’une colonne est exposée à des changements de pression rapides ou est utilisée dans des conditions de pH ou de température qui entraînent l’hydrolyse des particules de substrat de la phase stationnaire. Ce phénomène est fréquent lorsque les colonnes à base de silice sont utilisées avec des phases mobiles basiques (pH>7), notamment à des températures élevées (>30 °C) [J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr. A 691 (1995), p. 3–19, H. A. Claessens, M. A. van Straten, J. J. Kirkland, J. Chromatogr. A 728 (1996), p. 259–270]. Une troisième cause envisageable est l’accumulation des composés de la matrice de l’échantillon dans le système HPLC ou dans la colonne. De nombreux échantillons contiennent des composés susceptibles de précipiter ou de s’adsorber fortement sur les surfaces du système et de la colonne, par exemple des protéines, des lipides, des polysaccharides et des agents tensioactifs. Lorsque ces composés s’accumulent sur les surfaces du système ou de la colonne, ils peuvent perturber la répartition du flux, ce qui entraîne des modifications de la forme pour tous les pics.

Prenons les chromatogrammes de la figure 2. Le chromatogramme initial présente cinq pics avec de bons facteurs de traînée, compris entre 1,01 et 1,09. Après 200 injections d’échantillons, on constate que les cinq pics présentent des facteurs de traînée plus élevés, compris entre 1,61 et 1,97. La contre-pression de la colonne n’a connu qu’une faible augmentation (3,5 %) au cours des 200 injections.

Les analytes sont tous neutres dans les conditions de séparation, de sorte qu’un changement dans la concentration du groupe silanol à la surface de la phase stationnaire ne peut pas être à l’origine de la traînée des pics. La phase mobile ne contenait que de l’eau et de l’acétonitrile et la température de la colonne était de 40 °C. Il est donc peu probable qu’un vide se soit formé dans la colonne. Qu’en est-il de l’accumulation des composés de la matrice de l’échantillon dans la colonne ? Les échantillons contenaient des protéines, ainsi que des graisses et des sucres. La colonne utilisée pour cet exemple était équipée d’une colonne de garde intégrale amovible. Après remplacement de la colonne de garde, les facteurs de traînée des cinq composés ont été ramenés à des valeurs proches de 1, comme le montre le chromatogramme du bas. Cela confirme que l’apparition de traînée de pics était due à l’accumulation de composés de la matrice de l’échantillon dans la colonne de garde. Lorsque l’on travaille avec des échantillons contenant des composés de matrice susceptibles de précipiter ou de s’adsorber sur la colonne, l’utilisation d’une colonne de garde peut constituer une solution économique pour maximiser la durée de vie d’une colonne. Comme le montre cet exemple, elle est également un outil utile pour identifier la source des problèmes de forme des pics.