Approches pratiques sur la purification des peptides

Choix de la colonne

L’idéal serait d’utiliser une seule chimie de colonne pour tous les échantillons, y compris les peptides ordinaires (avec un mélange de résidus acides, basiques et apolaires), les peptides basiques, les gros peptides (30 à 40 résidus) et les peptides hydrophobes. Cela permettrait de réduire le stock de colonnes et d’éviter de tester plusieurs colonnes pour chaque échantillon brut. Alors que les phases C₁₈ sont généralement utilisées pour de nombreuses séparations de peptides, la particule de base à laquelle le C₁₈ est greffé influence aussi grandement le temps de rétention, la résolution et la finesse des pics. Les colonnes XBridge Peptide BEH sont basées sur des particules hybrides à ponts éthane plutôt que sur de la silice pure. La particule BEH (hybride à pont éthylsiloxane/silice) (figure 7) minimise les interactions secondaires avec les peptides et est stable à pH acide comme basique pour une flexibilité maximale dans le développement des séparations. La phase stationnaire synthétique est disponible avec une porosité de 130 ou 300 Å et une granulométrie de 3,5, 5 et 10 µm. Pour les échantillons atypiques ou les peptides extrêmement hydrophobes, la même particule de base est disponible avec les phases à greffage C₈ ou C₄.

Le tableau 1 présente une approximation de la capacité de charge des peptides pour diverses dimensions de colonne.

Tableau 1. Approximation de la capacité de charge des peptides en phase inverse

*Colonnes préparatives OBD de 5 et 10 µm ; **Colonnes préparatives OBD de 10 µm.

Plusieurs facteurs influencent la capacité de charge des colonnes préparatives. Les capacités indiquées représentent une estimation « moyenne » avec des débits et des volumes d’injection raisonnables pour chaque dimension. Les facteurs suivants doivent être pris en compte :
1) La capacité pour les peptides dépend principalement de la solubilité de l’échantillon en question.
2) La capacité est plus faible lorsqu’une résolution plus élevée est requise.
3) La capacité dépend des conditions de chargement, mais dans une moindre mesure que pour les petites molécules.
a) Les peptides sont généralement chargés dans des conditions fortement aqueuses, souvent avec ajout de TFA. Dans ces conditions, la capacité de charge volumique est pratiquement illimitée. La capacité est limitée par la solubilité pendant l’élution.
b) Les peptides séchés peuvent être humidifiés avec des solvants tels que le DMF ou le DMSO. Ils sont ensuite souvent dilués avec de l’eau contenant du TFA, comme décrit précédemment.
c) Dans certains cas, les peptides seront dissous dans du DMF ou du DMSO avant d’être injectés dans cette solution. Les recommandations de volume du tableau s’appliquent à cette condition.
4) Les volumes d’injection raisonnables sont basés sur un diamètre de colonne de 50 mm avec des solvants relativement forts. Il est possible d’augmenter le volume d’injection avec des colonnes plus longues, mais pas de manière proportionnelle. L’utilisation de solvants plus faibles augmente considérablement le volume d’injection.
5) Le débit raisonnable dépend du diamètre de la colonne. Les systèmes seront limités par l’augmentation de la contre-pression observée avec une colonne plus longue et une granulométrie plus faible. Certains utilisateurs préfèrent traiter les peptides plus lentement que les petites molécules. Dans ce cas, il est recommandé de diviser le débit recommandé par deux, et de doubler la durée de gradient.

Sur la base des résultats d’un test réalisé sur un panel de quatre peptides de propriétés différentes, il a été déterminé que la colonne XBridge Peptide BEH C₁₈ de 130 Å était la colonne la mieux adaptée à la purification des peptides. Les séquences peptidiques sont déposées, mais les principales propriétés de chaque peptide sont répertoriées dans le tableau 2.

Tableau 2. Propriétés des peptides testés

Les peptides sont amphiprotiques du fait de la présence à la fois de groupes fonctionnels faiblement acides (acide carboxylique) et faiblement basiques (amine). Les peptides ayant à la fois des charges positives et négatives, ils sont appelés zwitterions. Si l’on soumet à un champ électrique un peptide dissous dans une solution ayant une concentration en ions hydrogène donnée et qu’il ne migre pas, cette concentration en ions hydrogène est le point isoélectrique (pI) du peptide. Pour faire simple, le point isoélectrique (pI) correspond donc au pH auquel le peptide a une charge nette nulle.

Comme décrit par Browne, Bennet et Solomon, l’indice HPLC permet de prédire le pourcentage d’acétonitrile nécessaire pour éluer le peptide dans une colonne C₁₈ µBondapak en utilisant comme système tampon un mélange TFA:eau:acétonitrile. Ils ont isolé des peptides à partir de matrices biologiques et ont prédit le profil d’élution en fonction de la composition en acides aminés. Par conséquent, des valeurs d’indice HPLC élevées suggèrent une forte hydrophobicité sur une colonne C₁₈. Bien entendu, les valeurs ne seront pas les mêmes avec d’autres colonnes et phases mobiles, mais ce système simple donne une indication sur la nature des peptides.

La figure 8 présente le profil chromatographique des quatre peptides du panel dans des conditions très courantes, à savoir acide formique à 0,1 % dans l’eau et dans l’acétonitrile avec un gradient de 50 minutes passant de 5 à 50 %B. Les quatre peptides présentent des caractéristiques chromatographiques parfaitement acceptables avec des pics symétriques et nets.

Il est important de vérifier si l’utilisation d’une colonne d’une porosité de 300 Å peut améliorer la séparation des peptides volumineux ou hydrophobes. Pour le plus gros peptide du panel testé avec 39 résidus et une masse moléculaire supérieure à 4 000 Da, on observe une faible amélioration de la finesse des pics avec la phase stationnaire ayant des pores plus larges (figure 9). Le peptide élue légèrement plus tôt, la différence étant équivalente à environ 1 à 2 % d’acétonitrile. La phase stationnaire ayant une porosité de 130 Å présente une limite de taille, se situant très probablement au-delà d’environ 40 résidus.

Le peptide hydrophobe, avec un indice HPLC de 113, élue également sous forme d’un pic symétrique et net avec les phases stationnaires de 130 et 300 Å (figure 10). La conformation du peptide, c’est-à-dire la façon dont le peptide est replié en solution, peut également avoir une incidence sur la porosité à utiliser pour une séparation donnée. De la même manière qu’il n’existe pas de règles absolues pour la capacité de charge, les propriétés individuelles des peptides jouent également un rôle dans le choix de la porosité la plus adaptée. À partir des expériences décrites ci-dessus, il peut être suggéré que les colonnes XBridge Peptide BEH, avec une phase greffée C₁₈ et une porosité de 130 Å, constituent un point de départ raisonnable pour la purification des peptides.

Pour la purification des peptides à plus grande échelle, la granulométrie joue un rôle important en termes de coûts et d’efficacité. L’analyse du peptide basique sur trois colonnes de granulométrie différente illustre la constance de la séparation (figure 11). Bien que les pics soient plus larges et moins bien résolus avec une granulométrie plus importante, la sélectivité chimique des colonnes BEH transposables ne change pas, que la granulométrie soit de 3,5, 5 ou 10 µm. Une granulométrie plus élevée s’avère avantageuse pour les purifications à grande échelle, puisqu’elle permet des débits plus rapides sur des colonnes de plus grand diamètre avec des limites de pression gérables. Le tout permet d’améliorer la capacité de charge, de réduire le nombre d’analyses chromatographiques et d’économiser du temps et des ressources.

Bien que les peptides aient des propriétés uniques qui influent sur leur purification à partir de mélanges bruts, les principes de base de la chromatographie préparative s’appliquent toujours. Alors qu’un protocole standard de purification des peptides avec un gradient générique (tel que 5–50 %B ou 5–95 %B) sur une colonne en phase inverse s’avère adapté la plupart du temps, les peptides dotés de propriétés uniques nécessitent parfois de développer une méthode de séparation pour atteindre certains critères de pureté, de charge et de rendement. Les méthodes chromatographiques peuvent souvent être améliorées en changeant le solvant de la phase mobile, le modificateur, la pente du gradient, la température, le pH ou la méthode d’introduction de l’échantillon. Chacun de ces facteurs a un impact sur la séparation, la qualité de la chromatographie et la performance de la purification.

Rôle du solvant

La phase mobile est constituée de trois composés : le solvant faible, le solvant fort et le modificateur. En chromatographie en phase inverse, le solvant faible est presque toujours de l’eau. Bien qu’on puisse considérer le méthanol, l’éthanol ou l’isopropanol comme de bons solvants forts, on leur préfère souvent l’acétonitrile en raison de sa faible viscosité, de sa force légèrement supérieure et de sa compatibilité avec la détection UV à faible longueur d’onde (185–205 nm). L’acétonitrile permet généralement d’obtenir la meilleure finesse de pic, s’évapore facilement et réduit le nombre de réactions secondaires susceptibles de se produire pendant la purification et le traitement. Sa bonne transparence aux UV permet d’obtenir un rapport signal/bruit élevé pour une meilleure détection des pics. Toutefois, l’acétonitrile peut sembler inadapté dans certains cas, notamment lorsqu’on souhaite utiliser le peptide dans des tests biologiques.

On le remplacera alors par un alcool, tel que l’éthanol, pour réduire la toxicité résiduelle qui peut être associée à l’acétonitrile. En plus de répondre aux problèmes de biocompatibilité, le propanol ou les mélanges acétonitrile/propanol offrent souvent une meilleure solubilité des peptides volumineux ou hydrophobes et rompent les agrégats qui se forment parfois en solution. La figure 12 illustre l’effet d’un mélange isopropanol/acétonitrile à 70:30 sur le peptide basique. La résolution du pic principal est améliorée par rapport aux contaminants qui éluent à proximité et le temps de rétention est réduit de moitié environ. Des températures de colonne élevées sont généralement nécessaires avec les phases mobiles contenant des alcools en raison de leur viscosité plus élevée.

Rôle du modificateur de la phase mobile

La purification de peptides par chromatographie en phase inverse nécessite d’ajouter un modificateur polaire à la phase mobile, car les peptides possèdent à la fois des charges positives (terminaux amine) et négatives (terminaux carboxyle) qui réduisent l’affinité pour la surface hydrophobe de la phase stationnaire. Les groupes protecteurs des chaînes latérales peuvent également porter une charge, comme le montre la figure 13. Les modificateurs contrôlent le pH pour modifier le degré d’ionisation des chaînes latérales faiblement acides ou basiques. Le modificateur peut également former des paires d’ions avec le peptide. Il est possible d’optimiser la séparation d’un échantillon donné en jouant sur ces mécanismes.

L’acide formique abaisse le pH de la phase mobile, protonant ainsi les chaînes latérales acides du peptide et éliminant une partie de la charge négative (figure 14). Le nombre réduit de chaînes latérales d’acides aminés chargées augmente l’attraction vers la surface hydrophobe de la colonne, ce qui favorise la séparation. Bien que la plupart des silanols à la surface de la colonne puissent également être protonés, des silanols libres seront toujours disponibles pour se lier au peptide. Ces interactions peptide-silanol se manifestent sous forme de traînée de pics dans le chromatogramme.

L’acide trifluoroacétique (TFA), le modificateur le plus couramment utilisé, diffère par son mécanisme d’interaction avec la colonne et l’échantillon (figure 15). Le pH acide protone les chaînes latérales des peptides acides, et l’appariement d’ions neutralise les chaînes latérales basiques, inhibant leur liaison aux silanols libres, ce qui entraîne une traînée de pic. Conjointement, la réduction de la charge et l’appariement d’ions favorisent la rétention, nécessitant une concentration plus élevée de solvant organique pour l’élution.

Une colonne à particules hybrides à ponts éthane a pour avantage d’éliminer les interactions avec les silanols (figure 16). Il n’est plus nécessaire d’utiliser du TFA pour réduire la traînée des pics, car la phase stationnaire basique interagit moins avec le peptide. Il est possible d’utiliser de l’acide formique (FA) ou du TFA pour modifier la sélectivité de la séparation tout en conservant une bonne finesse de pics. La différence de rétention ainsi que le changement dans l’ordre d’élution peuvent permettre d’ajuster les conditions de purification, comme le montre la figure 17. L’astérisque identifie le même peptide contaminant dans les deux séparations, démontrant ainsi l’importance et l’utilité du changement de sélectivité.

Rôle du pH élevé

L’élévation du pH peut également être utilisée pour modifier l’interaction entre le peptide et la surface de la colonne hybride à ponts éthane. Avec des tampons tels que le bicarbonate d’ammonium, le pH basique déprotone et ionise les chaînes latérales peptidiques acides (figure 18). Le bicarbonate d’ammonium déprotone et neutralise également les chaînes latérales peptidiques basiques, ce qui réduit la charge du peptide et augmente son attraction sur la surface hydrophobe de la colonne. Les chaînes latérales du peptide basique ne se lient pas aux quelques silanols résiduels et la traînée des pics est réduite. En plus de ces avantages, le bicarbonate d’ammonium est volatil et relativement facile à éliminer du peptide purifié. L’hydroxyde d’ammonium, à 0,1 %, peut également être utilisé pour élever le pH de la phase mobile. Les fractions collectées s’évaporent facilement.

Les pH extrêmes modifient la sélectivité des séparations (figures 19 et 20). Le peptide acide (figure 19) présente une rétention plus longue sur une phase stationnaire en phase inverse à pH acide, car toutes les charges négatives sont neutralisées et le peptide interagit fortement avec la surface hydrophobe de la colonne. À pH basique, en revanche, le temps de rétention du peptide est plus court du fait d’un plus grand nombre de charges négatives, ce qui l’empêche d’adhérer aussi fortement à la phase stationnaire. Dans cet exemple, la forme du pic reste inchangée, mais le changement d’ordre d’élution peut être utilisé dans le développement de méthodes ou pour caractériser le peptide avec une stratégie orthogonale.

Comme attendu, le peptide basique (figure 20) présente un comportement inverse à des valeurs extrêmes de pH. À pH basique, les résidus basiques du peptide sont déprotonés et ne s’ionisent pas. La forte interaction du peptide avec la colonne nécessite une proportion plus élevée de solvant organique dans la phase mobile pour l’éluer de la colonne. Montrant une meilleure résolution à pH 10, le changement de sélectivité rend le pH plus élevé plus intéressant lorsque l’on souhaite optimiser la pureté du peptide.

Rappel : bien que les phases mobiles à pH acide et basique soient compatibles avec les colonnes à technologie de particules hybrides, les conditions de pH extrêmes ne doivent pas être utilisées avec des remplissages de colonne à base de silice. Un pH trop acide induira un clivage de la phase greffée. Un pH basique détruira le support de colonne de particules de silice. Vérifiez toujours les limites de plage de pH suggérées par le fabricant pour certaines colonnes à base de silice.

Rôle de la température

Le contrôle de la température est le plus souvent utilisé en chromatographie pour garantir la reproductibilité des séparations. Il revêt d’autres avantages pour la purification. Les peptides hydrophobes qui ont une solubilité limitée sont parmi les échantillons les plus difficiles à purifier. L’élévation de la température de séparation augmente la solubilité des peptides hydrophobes et améliore généralement la finesse de leurs pics chromatographiques. À terme, cela améliore la pureté et le rendement de la purification, rendant le processus plus rapide et plus efficace.

Dans la mesure où différentes températures ne donnent pas la même sélectivité chromatographique, le chauffage de la colonne s’avère très utile pour optimiser la séparation d’un échantillon donné. De plus, la viscosité de la phase mobile et la pression totale du système diminuent à température élevée. Une pression plus faible réduit les contraintes sur le système, les raccords et la colonne, et accroît en fin de compte la robustesse du fonctionnement.

Alors que le contrôle de la température en chromatographie analytique est pratique courante, il est plus rarement employé comme paramètre de manipulation de la chromatographie à l’échelle préparative pour deux raisons. Tout d’abord, les colonnes de grand diamètre ne peuvent pas être chauffées uniformément depuis l’extérieur. Ensuite, les séparations à débit élevé se produisent à la température du solvant entrant. Bien qu’ils soient satisfaisants pour les séparations à petite échelle, les couvertures thermiques et les fours à colonne ne peuvent pas chauffer uniformément de grandes colonnes. Leur utilisation induit des gradients de température sur le diamètre et sur la longueur de la colonne, nuisant à la chromatographie.

Pour chauffer efficacement la colonne, il faut placer une boucle de préchauffage de solvant à la tête de la colonne et immerger la totalité de la boucle et de la colonne dans un bain-marie équilibré à la température souhaitée (figure 21). Un débit continu de solvant dans la boucle de préchauffage assure l’équilibrage interne de la colonne, tandis que le bain-marie stabilise l’environnement externe de la colonne. La boucle de préchauffage du solvant a une incidence négligeable sur l’étalement des pics, car elle est constituée d’une tubulure de diamètre interne étroit. L’échantillon entrant est également refocalisé par adsorption en tête de colonne.

L’effet de l’utilisation du contrôle de température pour les séparations de peptides est illustré pour deux des peptides du panel testé : le peptide basique (figure 22) et le peptide acide (figure 23). Dans ces exemples (encadrés en rouge), les composés de l’échantillon du peptide basique sont mieux séparés à 60 °C, tandis que les composés du mélange brut de peptide acide sont mieux séparés à 40 °C. Ces observations ne sont toutefois que pure coïncidence, car il est pratiquement impossible de prédire la température optimale pour les peptides acides ou basiques et cela dépendra des propriétés spécifiques des séquences impliquées.

La modification du solvant, du modificateur de la phase mobile, du pH et de la température affecte considérablement la séparation des peptides. Chacun de ces paramètres peut être utilisé seul ou conjointement pour le développement de méthodes afin d’optimiser la chromatographie. Le choix d’une colonne unique garnie de particules hybrides stables, telle que la technologie de colonne XBridge Peptide BEH, peut simplifier le processus de purification en réduisant le nombre de colonnes et le temps de criblage requis pour la purification des peptides. En figure 24, la chromatographie du peptide basique illustre l’impact de petites variations sur la séparation. Pour ces peptides aux propriétés uniques, il peut être avantageux d’utiliser d’autres chimies de colonne pour optimiser la séparation.

Ciblage du gradient

Les séparations chromatographiques réalisées à des fins de purification sont régies par les mêmes principes physiques et chimiques que les séparations à l’échelle analytique. Toutefois, à l’échelle préparative, les scientifiques purifient les composés à des charges massiques élevées, souvent sur de grandes colonnes, et ont besoin d’une meilleure résolution pour améliorer la pureté et le rendement du produit recueilli. La création d’un gradient en pente douce peut être un bon point de départ lorsque l’on souhaite améliorer la résolution. Toutefois, la modification de la pente du gradient sur la totalité de la séparation peut élargir les pics et augmenter la durée totale de l’analyse. Les gradients segmentés et ciblés diminuent la pente du gradient uniquement sur la partie de la séparation nécessitant une résolution accrue, sans augmenter la durée totale d’analyse (figures 25 et 26).

Les gradients linéaires passent d’une teneur organique faible à une teneur organique élevée (c’est-à-dire 5–50 %B ou 5–95 %B) sur une période définie et sont souvent utilisés pour le criblage d’échantillons. Ils peuvent également être utilisés pour la chromatographie préparative si la résolution entre les composés de l’échantillon est bonne et que la durée d’analyse est raisonnablement courte. Les gradients segmentés conservent la même pente avant et après la partie ciblée en pente plus douce de la méthode, préservant le profil chromatographique de ces parties de la séparation. La partie ciblée du chromatogramme présente une pente de gradient plus douce, ce qui éloigne efficacement les impuretés éluant à proximité du pic d’intérêt.

Les gradients ciblés sont destinés à cibler uniquement le produit. La force du solvant passe rapidement des faibles concentrations utilisées pour le chargement de l’échantillon à environ 5 % sous le point d’élution attendu pour le pic de produit. En général, la partie en pente douce du chromatogramme progresse à environ un cinquième de la pente de la séparation d’origine jusqu’à environ 3 % au-dessus de l’élution attendue pour le pic de produit. Une fois la partie en pente douce du gradient terminée, le pourcentage de phase mobile organique est rapidement augmenté pour laver la colonne de tout contaminant restant. En raison de la complexité des mélanges de peptides, la meilleure résolution se situe souvent autour de 0,25 %–0,33 % de variation par volume de colonne. Cette variation est légèrement plus douce que si l’on divise la pente du gradient de criblage d’origine par cinq, comme on le fait généralement pour les petites molécules et les échantillons de peptides moins complexes.

Le volume du système est utilisé dans la conception du gradient ciblé, ainsi que dans la transposition de base de l’échelle analytique à l’échelle préparative. Le volume du système, également appelé volume de retard, est défini comme le volume entre le point de formation du gradient et la tête de la colonne, et inclut tous les composants du circuit fluidique HPLC, les têtes de pompe, les amortisseurs d’impulsions, les mélangeurs, la boucle d’injection et les tubulures. Lors de la transposition géométrique, où la pente est préservée aux échelles analytique et préparative, le volume du système impose d’appliquer un palier isocratique avant le début du gradient. Ce palier peut correspondre à plusieurs volumes de colonne à petite échelle ou à une fraction de volume de colonne à grande échelle. On programme un palier isocratique aux conditions initiales pour compenser la différence de volume du système entre les échelles analytique et préparative, garantissant ainsi que le gradient réel commence exactement au même moment.

En utilisant un gradient en escalier (tableau 3) dans lequel le solvant de la phase mobile A est pur et le solvant de la phase mobile B contient un absorbeur UV approprié (c’est-à-dire de l’acétone à 2 mL/L), le volume du système peut être facilement calculé à l’aide de la procédure et des calculs présentés en figures 27 et 28.

Tableau 3. Gradients en escalier pour la détermination du volume du système à l’échelle analytique et à l’échelle préparative.

Il est possible d’estimer le volume du système, le volume de la colonne et le pourcentage de solvant fort qui élue le peptide, puis de créer le gradient segmenté ou ciblé à partir de ces estimations pour gagner du temps. Toutefois, il est intéressant de déterminer expérimentalement le volume du système et d’enregistrer ces valeurs pour les expériences ultérieures. Le volume du système reste constant tant que les tubulures HPLC ne sont pas changées et que le débit de la méthode est identique à celui utilisé pour mesurer le volume du système. Une fois le volume du système déterminé expérimentalement, les modifications apportées au système (comme la taille de la boucle d’injection) sont faciles à calculer et ne nécessitent pas de remesurer le volume. Lorsque vous avez déterminé le volume du système, vous pouvez l’utiliser pour calculer le gradient ciblé.

Conception du gradient ciblé

Les gradients ciblés sont généralement conçus sur la base de l’analyse du mélange d’échantillon brut, mais la procédure est la même pour la modification d’un gradient qui a déjà été utilisé dans une première préparation. Il est facile de créer un gradient ciblé à partir des équations présentées ci-après. Supposons que le gradient ciblé sera calculé à partir du gradient suivant : colonne de 4,6 x 100 mm, volume du système de 1,0 mL, volume de colonne de 1,097 mL*
Temps de rétention du pic = 7,76 min

*Le volume d’une colonne peut être déterminé à l’aide d’un calculateur disponible sur Internet, ou en utilisant le volume d’un cylindre : V = πr2h. Les valeurs seront légèrement différentes en fonction de la méthode choisie, car certaines calculatrices réduisent le volume de liquide pour tenir compte du remplissage de la colonne. Tant que la même méthode est utilisée pour tous les calculs, il n’y aura pas d’impact sur la chromatographie.

La figure 29 montre le chromatogramme du peptide de synthèse brut analysé avec ce gradient.
Calcul du décalage entre le point de formation du gradient et le détecteur :

Décalage = volume du système + volume de la colonne

Exemple :
Décalage = 1,0 mL + 1,097 mL
Décalage = 2,097 mL
Calcul du temps nécessaire au solvant pour atteindre le détecteur :
Temps jusqu’au détecteur = Décalage, en mL
Débit en mL/min

Exemple :
Temps jusqu’au détecteur = 2,097 mL / 1,46 mL/min
Temps jusqu’au détecteur = 1,43 min
 

Calcul du temps de formation de la concentration à laquelle élue le pic

Temps de la concentration d’élution =
Temps de rétention du pic – Temps jusqu’au détecteur – Palier de gradient

Exemple :
Temps de la concentration d’élution = 7,76 min – 1,43 min – 0,00 min
Temps de la concentration d’élution = 6,33 min

Calcul de l’élution du pic en %

Concentration d’élution du pic en % =
Temps de la concentration d’élution/ Durée test X Variation test /
Segment de gradient + Gradient initial test en % / Segment de gradient

Exemple :
Concentration d’élution du pic en % = 6,33 min / 10 min X 45 % + 5 %
Concentration d’élution du pic en % = 33,48 %

REMARQUE : Pour tous les calculs impliquant un pourcentage, utilisez uniquement des valeurs absolues, c’est-à-dire 45 × 6,33 min, et non 0,45 × 6,33.
 

Calcul de la pente du gradient test en % de variation par volume de colonne

Nombre de volumes de colonne (VC) =
1 VC X Débit en mL X Temps du segment de gradient / mL min

Exemple :
Nombre de volumes de colonne = 1 VC X 1,46 mL X 10 min / 1,097 mL min
Nombre de volumes de colonne = 13,3 VC

Exemple :
Pente du gradient test = Variation en % du gradient test
Pente du gradient test = 45 % / 13,3 VC = 3,38 % / VC

Calcul de la pente du gradient ciblé en % de variation par volume de colonne (1/5 de la pente du gradient test)

Pente du gradient ciblé en %/VC = 1/5 × Pente du gradient test

Exemple :
Pente du gradient ciblé = 1 X 3,38 % / 5 VC
Pente du gradient ciblé = 0,67 % / VC

Créez un segment de gradient ciblé de 5 % en dessous à 3–5 % au-dessus du pourcentage d’élution estimé. Le pic élue à 33,5 % d’acétonitrile. Le gradient en pente plus douce doit aller de 28 % à 36 % d’acétonitrile. Calcul du temps du segment de gradient ciblé :

Temps du segment de gradient ciblé =
Variation en % X Pente du gradient ciblé X Volume de la colonne X Débit en mL

Exemple :
Temps du segment de gradient ciblé =
8 % X 1 VC / 0,67 % X 1,097 mL / 1 VC X 1 min / 1,46 mL
Temps du segment de gradient ciblé = 9,0 min
 

Notez le gradient ciblé, qui commence aux conditions initiales du test et remonte rapidement jusqu’à 5 % en dessous du pourcentage d’élution du pic.

La partie supérieure de la figure 30 représente le chromatogramme obtenu pour le peptide brut analysé à l’aide du gradient ciblé. Les impuretés qui éluent à proximité sont mieux résolues, mais le résultat est encore plus concluant lorsque l’on diminue la pente jusqu’à environ un dixième de la pente initiale (partie inférieure). Cet exemple illustre clairement l’impact que peut avoir la réduction de la pente jusqu’à 0,25–0,33 % par volume de colonne sur la séparation d’un mélange de peptides complexes. Notez que le temps de rétention du pic du peptide principal est toujours d’environ 7 minutes, soit approximativement le même temps que pour le gradient de criblage d’origine. Ainsi, le ciblage du gradient a permis d’améliorer la résolution sans allonger la durée de l’opération. Alors que la durée globale d’exécution du gradient est plus longue, d’autres techniques, telles que l’arrêt prématuré de l’opération, peuvent permettre d’accélérer le processus de purification à plus grande échelle. Ce peptide a été finalement purifié en transposant géométriquement le gradient ciblé en pente plus douce.

Introduction de l’échantillon

Il n’existe pas de solvant ni de technique universels pour dissoudre les peptides de synthèse, car la composition et la séquence des peptides influent directement sur la solubilité. Parmi les solvants couramment utilisés, on peut citer : l’eau additionnée de 0,1–2 % d’acide trifluoroacétique, d’acide formique ou d’acide acétique, le diméthylsulfoxyde, l’hexafluoroisopropanol, le chlorure de guanidinium 6–12 M, le diméthylformamide, l’hydroxyde d’ammonium à 0,1 % ou le bicarbonate d’ammonium 10 mM. Certains fabricants fournissent des conseils pratiques pour dissoudre différents types de peptides. La dissolution du peptide produit souvent un volume d’échantillon relativement important dans un solvant fort.

Dans les systèmes de chromatographie préparative classiques (figure 31), des volumes d’injection importants de diluants d’échantillons forts déforment souvent le chromatogramme, réduisant ainsi la quantité de produit pouvant être purifiée avec succès. Lorsque la charge augmente, les impuretés éluant à proximité ne sont plus bien résolues. La précipitation de l’échantillon due à la présence d’une phase mobile aqueuse de part et d’autre de l’échantillon dans la boucle ou sur la tête de la colonne diminue la robustesse du système et la durée de vie de la colonne.

Dans les séparations classiques, un échantillon est introduit dans la colonne dans du DMSO, ou un autre solvant fort. Le tout descend immédiatement dans la colonne, entraînant avec lui les molécules de l’échantillon (figure 32). L’échantillon n’est retenu que lorsque le solvant fort est dilué dans la colonne. Malheureusement, le temps que les bandes d’échantillons ne soient retenues sur la colonne, elles sont déjà larges et migrent les unes dans les autres sur le lit de la colonne. Lorsque les composés de l’échantillon éluent de la colonne, les bandes ne sont pas distinctes et la pureté de chaque composé est médiocre.

Une autre technique d’injection appelée « at-column dilution », ou ACD, permet d’injecter de grands volumes de solvants forts et d’améliorer simultanément la solubilité de l’échantillon, le chargement de la colonne et la résolution. Avec l’ACD, le système chromatographique est raccordé de sorte que l’échantillon dans un solvant fort soit dilué en amont de la colonne avec une phase mobile aqueuse (figure 33). L’échantillon est très rapidement mélangé et adsorbé sur la colonne. La vitesse de transfert est si rapide qu’il ne peut pas y avoir de précipitation. Le solvant fort commence à sortir de la colonne avant même le début de l’élution de l’échantillon.

Une fois le gradient amorcé, les composés de l’échantillon éluent sous forme de bandes étroites, de faible volume et bien résolues (figure 34).

La résolution améliorée entre les pics des composés de l’échantillon permet d’augmenter la taille de l’échantillon et donc de réduire le nombre d’injections nécessaires à la purification. En pratique, le chargement de la colonne peut souvent être multiplié par trois à cinq avec la technique « at-column dilution » (figure 42). Cette technique améliore la robustesse du système, car elle limite la précipitation de l’échantillon dans la boucle ou à l’entrée de la colonne. La fréquence des arrêts haute pression est réduite et la durée de vie de la colonne est allongée.

Exemple pratique de purification d’un peptide

Les principes de la chromatographie préparative s’appliquent à tous les types de molécules, y compris les peptides. L’exemple suivant illustre un protocole typique pour la purification d’un peptide dans un contexte de recherche et applique les facteurs d’optimisation de méthode présentés précédemment. Ce protocole peut être modifié en fonction des procédures de chaque laboratoire.

Le peptide utilisé dans cet exemple a une longueur de 17 acides aminés avec 3 résidus basiques, 2 résidus acides, 8 résidus apolaires et 4 résidus polaires. L’échantillon a été dissous dans du diméthylsulfoxyde, mélangé au vortex et traité aux ultrasons. Il a ensuite été passé à travers un filtre pour seringue GHP Acrodisc de 0,45 µm. Le peptide avait une masse monoisotopique de 1 772,9 Da et présentait les états de charge suivants :
[M+H]⁺ = 1 773,9
[M+2H]²⁺ = 887,5
[M+3H]³⁺ = 592,2
[M+4H]⁴⁺ = 447,2

Profil de peptide brut

L’échantillon de peptide brut a été analysé avec deux modificateurs différents (0,1 % d’acide formique et 0,1 % d’acide trifluoroacétique) dans la phase mobile afin de déterminer lequel donnerait la meilleure séparation. Alors que l’acétonitrile est le plus souvent utilisé comme composant organique de la phase mobile, cet exemple utilise plutôt de l’isopropanol à des fins d’illustration. Les résultats sont présentés en figure 35. On voit que le modificateur TFA (tracés A et B) produit un pic de produit plus net avec des contaminants bien résolus par rapport à l’acide formique (tracés C et D). Les quatre analyses ont été réalisées à 40 °C. La séparation a également été évaluée à 25 °C et 60 °C, mais une température de 40 °C a permis d’obtenir une finesse de pic et une résolution optimales pour les composés de l’échantillon (figure 36). La température légèrement élevée permettait également de réduire la contre-pression du système attribuée à l’utilisation de l’isopropanol comme composant organique de la phase mobile.

Ciblage du gradient

Après avoir optimisé le modificateur de la phase mobile et la température pour l’analyse du peptide brut, le gradient a été ciblé pour améliorer la résolution des pics de contaminants à élution proche. La colonne de 4,6 × 50 mm avait un volume de 0,698 mL et le volume du système a été mesuré à 0,77 mL. La méthode HPLC utilisée pour l’analyse du peptide brut est présentée ci-dessous :

Calcul du décalage entre le point de formation du gradient et le détecteur

Décalage = Volume du système + Volume de la colonne

Exemple :
Décalage = 0,77 mL + 0,698 mL
Décalage = 1,468 mL
 

Calcul du temps nécessaire au solvant pour atteindre le détecteur :

Temps jusqu’au détecteur =
Décalage en mL / Débit en mL/min

Exemple :
Temps jusqu’au détecteur = 1,468 mL / 1,46 mL/min
Temps jusqu’au détecteur = 1,00 min
 

Calcul du temps de formation de la concentration à laquelle élue le pic

Temps de la concentration d’élution =
Temps de rétention du pic – Temps jusqu’au détecteur – Palier de gradient

Exemple :
Temps de la concentration d’élution = 3,23 min – 1,00 min – 0,50 min
Temps de la concentration d’élution = 1,73 min

Calcul de l’élution du pic en %

Concentration d’élution du pic en % =
Temps de la concentration d’élution / Durée test X Variation test / Segment de gradient +
Gradient initial test en % / Segment de gradient

Exemple :
Concentration d’élution en % = 1,73 min X 30 % + 0 % / 4,78 min
Concentration d’élution en % = 10,85 %

REMARQUE : pour tous les calculs impliquant un pourcentage, utilisez uniquement des valeurs absolues, c’est-à-dire 30 × 1,73 min, et non 0,30 × 1,73.

Calcul de la pente du gradient test en % de variation par volume de colonne

Nombre de volumes de colonne (VC) =
1 VC X Débit en mL X Temps du segment de gradient X mL min

Exemple :
Nombre de volumes de colonne = 1 VC X 1,46 mL X 4,78 min / 0,698 mL
Nombre de volumes de colonne = 9,99
Pente du gradient test = Variation en % du gradient test
Nombre de volumes de colonnes

Exemple :
Pente du gradient test = 30 % / 9,99 VC = 3,0 % / VC

Calcul de la pente du gradient ciblé en % de variation par volume de colonne (1/5 de la pente du gradient test)

Pente du gradient ciblé en %/VC =
1/5 X Pente du gradient test

Exemple :
Pente du gradient ciblé = 1 X 3,0 % / 5 VC
Pente du gradient ciblé = 0,6 % / VC


Créez un segment de gradient ciblé de 5 % en dessous à 3–5 % au-dessus du pourcentage d’élution estimé. Le pic élue à 10,85 % d’acétonitrile. Par conséquent, le gradient en pente douce a été conçu pour passer de 5–13 % d’acétonitrile en 6,37 min.

Temps du segment de gradient ciblé =
Variation en % X pente du gradient ciblé X Volume de la colonne X Débit en mL

Exemple :
Temps du segment de gradient ciblé = 8 % / 0,6 % X 0,698 mL / 1 VC X 1 min / 1,46 mL
Temps du segment de gradient ciblé = 6,37 min


Notez le gradient ciblé, qui commence aux conditions initiales du test et remonte rapidement jusqu’à 5 % en dessous du pourcentage d’élution du pic.

Une fois le gradient ciblé créé, la séparation des échantillons de peptide brut a été évaluée (figure 37A). Un petit pic d’impuretés élue juste avant le pic de produit, mais il est à peine perceptible. En doublant la charge (figure 37B, 72 µg), l’impureté était plus visible, mais le pic principal était encore relativement pur. En quadruplant la charge initiale de 36 µg, le chromatogramme affichait une impureté plus prononcée. Ces conditions réduiraient sans doute la probabilité d’obtenir un produit pur si cette charge était géométriquement mise à l’échelle d’une colonne plus grande pour la préparation (figure 37C). Avec une charge de 256 µg sur la colonne analytique, l’impureté coélue complètement avec le pic principal (figure 37D).

Transposition à l’échelle préparative

La charge de 72 µg sur la colonne analytique a été sélectionnée pour la transposition géométrique à l’échelle préparative. Tout en restant prudente, cette charge augmenterait la probabilité d’obtenir une quantité raisonnable de produit pur tout en réalisant moins d’injections que si l’on transposait le volume d’injection le plus bas. La charge massique est proportionnelle au volume de la colonne et est déterminée à l’aide d’un calculateur de préparation ou en résolvant M2 dans l’équation suivante, où :

M1 est la charge massique sur la colonne 1 et M2 la charge massique sur la colonne 2
L1 est la longueur et d1 le diamètre de la colonne 1. L2 est la longueur et d2 le diamètre de la colonne 2

M2 = M1 X L2 / L1 X d22 / d12
M2 = 72 μg X 100 mm / 50 mm X 19 mm2 / 4,6 mm2

M2 = 72 g X 36 100 / 1 058
M2 = 2 456 µg ou 2,4 mg

44,03 mg de peptide brut ont été dissous dans 5 mL de DMSO (concentration de 8,80 mg/mL). Puis, la solution a été filtrée. La transposition géométrique de la charge de 72 µg sur la colonne analytique de 4,6 × 50 mm vers la colonne préparative de 19 × 100 nécessitait une injection de 2,4 mg, comme calculé ci-dessus. Avec une concentration de peptide brute de 8,80 mg/mL, le volume d’injection a été calculé :

Volume d’injection = 2,4 mg X 1 mL / 8,80 mg/mL
Volume d’injection = 0,272 mL ou 272 µL

Le gradient ciblé analytique a été transposé à l’échelle préparative, en prenant en compte les volumes du système aux deux échelles (tableau 4). Alors que le volume de retard semblait élevé pour le système préparatif, il comprenait une boucle de préchauffage de 5 mL pour le chauffage de la colonne, ainsi qu’une boucle d’injection de 2 mL. Compte tenu de ces contributions au volume du système, les 2,75 mL imputables aux tubulures restantes du système étaient tout à fait raisonnables. Le pic de produit a été recueilli en fonction du temps (figure 38).

Tableau 4. Transposition du gradient.

• Colonne : 4,6 × 50 mm Colonne : 19 × 100 mm
• Volume de retard du système : 0,77 mL Volume de retard du système : 9,75 mL
• Volume de la colonne : 0,698 mL Volume de la colonne : 23,804 mL
• Volume de retard du système (en volumes de colonne) : 1,10 Volume de retard du système (en volumes de colonne) : 0,41 Décalage de gradient : 0,66

Analyse des fractions

Le pic de produit peptidique a été recueilli en deux fractions. Ces deux fractions étaient très pures, comme le montre la figure 39. Le pic large qui élue à environ 2,25 minutes dans chacune des analyses de fractions et dans le blanc était très probablement dû à la faible concentration de l’acide trifluoroacétique responsable de l’appariement des ions dans la phase mobile. Les constituants hydrophobes du TFA s’accumulent généralement sur la colonne, puis éluent pendant le gradient. Le contaminant ne provenait d’aucun composant du système, comme l’injecteur ou la vanne, car un autre blanc sans la colonne ne présentait aucun pic dans le chromatogramme (figure 40).

Technique « at-column dilution »

Même si le peptide a été isolé avec une pureté élevée, l’augmentation de la charge d’échantillon par injection améliorerait l’efficacité du processus et réduirait le nombre d’analyses chromatographiques nécessaires pour purifier la quantité de produit requise pour les expériences suivantes. Comme indiqué précédemment, la technique « at-column dilution » permet de gérer efficacement des charges d’échantillons plus élevées en changeant simplement les tubulures du système (figure 33).

Bien que le taux de variation de la proportion de solvant B par volume de colonne pour la purification du peptide avec la technique « at-column dilution » soit la même que celui utilisé pour la séparation classique transposée de manière géométrique, le tableau de gradient programmé a été modifié pour inclure la contribution du solvant organique introduit par la pompe auxiliaire de chargement de l’échantillon (tableau 5).

Tableau 5. Comparaison de gradient : méthodes classiques et « at-column dilution »

Temps de gradient : 14,40–1,66 = 12,74 min Temps de gradient : 16,00–3,26 = 12,74 min
Volume de gradient : 12,74 min × 25 mL/min = 318,5 mL Volume de gradient : 12,74 min × 25 mL/min = 318,5 mL
Volumes de colonne : 318,5 mL × 1 VC/23,804 mL = 13,38 VC Volumes de colonne : 318,5 mL × 1 VC/23,804 mL = 13,38 VC
Pente de gradient : 8 %/13,38 VC = 0,6 %/VC Pente de gradient : 8 %/13,38 VC = 0,6 %/VC
Débit de la pompe de chargement durant le gradient = 1,25 mL/min
1,25 mL/min = 5 % du débit total
Débit total de la méthode en gradient = 25 mL/min

La pompe ACD introduit le solvant organique directement dans la boucle d’injection et est programmée pour fonctionner à 5 % du débit total. Le débit de la pompe chromatographique passe donc de 25 mL/min dans la méthode classique à 23,75 mL/min dans la méthode avec technique « at-column dilution ». Notez que le débit total est toujours de 25 mL/min (23,75 mL/min + 1,25 mL/min). La pompe ACD étant raccordée directement à l’injecteur, on insère au début du gradient une étape de maintien aux conditions initiales, suffisamment longue pour assurer le transfert complet de l’échantillon de la boucle à la colonne. Ce système est configuré avec une boucle de 2 mL et le palier initial était de 0,66 min.

Calcul du palier pour la méthode avec technique « at-column dilution » : boucle de 2 mL x (1 min/1,25 mL)=1,6 min
1,60 min + 0,66 min de maintien dans la méthode préparative d’origine = 2,26 min de maintien pour la méthode avec technique « at-column dilution ».

Les proportions de solvants A et B dans la méthode en gradient sont également modifiées pour refléter la contribution de la pompe ACD. Le gradient ciblé commence à 5 % B et passe à 13 %. Dans la mesure où 5 % du débit total sont délivrés à un débit constant de 1,25 mL/min d’isopropanol par la pompe ACD, les proportions de B dans la méthode avec technique « at-column dilution » sont respectivement programmées à 0 % et 8 % B. Notez que, bien que la méthode avec technique « at-column dilution » soit programmée de façon légèrement différente, le gradient réel est identique à celui de la méthode classique. Dans la mesure où ce peptide élue à un faible pourcentage de B, le temps réellement passé à 5 % B est plus long dans la méthode avec technique « at-column dilution », si on intègre le temps nécessaire pour passer de 0 à 5 %B dans la méthode préparative classique dans le palier de la méthode avec technique « at-column dilution ». Ces deux étapes sont programmées sur des lignes distinctes dans la méthode ACD par souci de lisibilité. Les proportions de solvant B étant diminuées pour tenir compte des 5 % délivrés par la pompe ACD, les proportions de A doivent être augmentées de 5 % pour que le gradient reste identique à celui de la méthode d’injection classique d’origine. Si la séquence d’injection du système chromatographique comporte des étapes de lavage, vérifiez que toutes les lignes de lavage sont amorcées et remplies de solvant de lavage fort.

La purification à grande échelle transposée géométriquement ayant été réalisée à 40 °C, la température a été maintenue pour l’injection avec la technique ACD. La boucle de préchauffage du solvant a été insérée juste avant le raccord en T dans le flux de solvant aqueux (figure 41).

La boucle de préchauffage du solvant, le raccord en T et la colonne sont ensuite immergés dans le bain-marie. Avant de démarrer la séparation en gradient, on a laissé la pression se stabiliser, ce qui impliquait que l’état d’équilibre du système avait été atteint. Alors que la quantité maximale d’échantillon pouvant être injectée avec la configuration classique correspondait à 2,4 mg de peptide, on a pu introduire 5 fois cette quantité, soit 12 mg (soit 1,36 mL) dans la colonne avec le système en configuration « At-column dilution » (figures 42 et 43). Les fractions ont été recueillies en fonction du temps, puis analysées à l’aide de la méthode de criblage d’origine à 0–30 % B. Les fractions présentaient une excellente pureté et étaient comparables à celles collectées lors de la préparation utilisant la technique d’injection classique (figure 44).

Considérations particulières pour les peptides hydrophobes

Un peptide hydrophobe composé de 15 résidus d’acides aminés non chargés (12 apolaires et 3 polaires) a été dissous dans du diméthylsulfoxyde. Le gradient ciblé de préparation présenté ci-dessous a été utilisé pour la purification sur une colonne de 19 × 100 mm avec le système chromatographique raccordé pour une injection classique. L’hydrophobicité extrême du peptide exigeait l’utilisation d’un débit et d’une charge d’échantillon réduits et d’une température de 60 °C.

Bien que ce peptide soit un bon candidat pour la technique « at-column dilution », l’augmentation de la charge massique sur la colonne présente un risque de précipitation. Le peptide éluant à environ 50 % d’acétonitrile, le chargement de cet échantillon à 5 % B (comme dans l’exemple précédent) est tellement inférieur à la force d’élution requise que le peptide est susceptible de précipiter lorsqu’il est dilué à l’entrée de la colonne. L’augmentation du pourcentage de solvant organique provenant de la pompe chromatographique pendant l’étape de chargement permet d’atténuer le risque de précipitation. En général, pour les composés extrêmement hydrophobes, l’utilisation dans la méthode du gradient d’un pourcentage initial de solvant organique qui est inférieur de 20–25 % par rapport pourcentage d’élution attendu du composé permet d’éviter la précipitation de l’échantillon, tout en préservant les avantages de la technique « at-column dilution ». Le gradient ACD modifié ci-dessous a été utilisé pour charger cinq fois plus d’échantillon sur la colonne de 19 × 100 mm (figure 45).

Le gradient a commencé à 48 % B (43,6 % B + 5 % B provenant de la pompe ACD) et s’est terminé à 53 % d’acétonitrile en 29 minutes avec une pente de 0,49 % de variation par volume de colonne, ce qui correspond à la vitesse de variation du gradient utilisé pour l’injection classique. La pompe ACD achemine l’échantillon de peptide depuis la boucle de 5 mL vers le raccord en T dans de l’acétonitrile à 100 %, où il rencontre la phase mobile de la pompe chromatographique aux conditions initiales, c’est-à-dire 23,6 % B (18,6 % B + 5 % B provenant de la pompe ACD). Le palier de 9,2 minutes au début de la méthode permet de garantir que l’échantillon est entièrement chargé sur la colonne. La pompe ACD fonctionnait à un débit constant de 0,8 mL/min, soit 5 % du débit total de 16,3 mL/min.

Toutes les colonnes doivent être nettoyées de temps en temps, qu’elles soient utilisées pour la séparation de petites ou de grosses molécules. Une contre-pression élevée, un bruit de fond chromatographique élevé et la présence de pics fantômes ne pouvant pas être attribués à l’échantillon sont autant de signes indiquant que la colonne doit être nettoyée.

Le meilleur moyen de prolonger la durée de vie d’une colonne est d’éviter l’accumulation de contaminants. Il est recommandé de filtrer tous les échantillons avant l’injection. L’ajout d’un filtre intégré ou d’une colonne de garde en amont de la colonne permet de piéger les particules et autres composés indésirables présents dans le mélange. Le lavage de la colonne avec deux à trois volumes de colonne d’un solvant à forte teneur organique après chaque séparation permet d’éliminer systématiquement les contaminants indésirables. Enfin, la technique « at-column dilution » maintient les échantillons en solution, ce qui empêche les arrêts haute pression et assure le transfert efficace des composés de l’échantillon à travers le système de purification, qu’ils soient destinés au collecteur de fractions ou au récipient à déchets.

Une contre-pression élevée qui se produit soudainement est souvent signe que l’échantillon se précipite quelque part dans le système, à savoir dans la boucle d’injection, la tubulure, la colonne ou la cellule de détection du détecteur. Avec la pompe du système chromatographique en marche, vous pouvez déterminer la source du problème en desserrant méthodiquement les raccords HPLC de la ligne d’évacuation des déchets jusqu’aux pompes. Une augmentation progressive de la contre-pression est probablement le résultat d’une accumulation d’impuretés sur la colonne après plusieurs injections et peut être rectifiée de différentes manières. Vous pouvez notamment exécuter de manière répétée des gradients rapides à température élevée, laver la colonne pendant une période prolongée avec une proportion élevée de solvant organique ou encore injecter un solvant de lavage comme le DMSO ou de l’acide formique à 1–10 % (figure 46).

La dépyrogénation, c’est-à-dire éliminer de la colonne les polysaccharides endotoxiques susceptibles de contaminer le produit final et d’induire une réaction allergique, nécessite généralement un lavage fort à l’hydroxyde de sodium 1 M pendant au moins une heure. Cette procédure est incompatible avec les colonnes actuelles.