Manuel d’initiation à la chromatographie d’exclusion stérique

Afin d’attribuer une masse moléculaire à chaque tranche de temps de rétention pour le polymère élué, nous devons étalonner notre système, ou plus précisément le banc de colonnes. Il existe plusieurs façons de procéder, mais la plus simple consiste à utiliser un étalonnage relatif basé sur un ensemble d’étalons polymères bien caractérisés avec une distribution des masses moléculaires aussi étroite que possible. L’idéal serait d’utiliser un ensemble d’étalons monodispersés, c’est-à-dire de masse moléculaire unique, avec un rapport entre la moyenne en poids et la moyenne en nombre (dispersité) égal à un (Mw/Mn = 1).

Pour y parvenir, le mieux est d’utiliser des étalons polymères spécialement polymérisés à cette fin, tels que les étalons étroits de polystyrène polymérisés anioniquement. Les étalons couvrent une très large plage de masses moléculaires, allant des monomères jusqu’à des masses moléculaires > 10 000 000, avec une dispersité < 1,10. Pour qu’une solution étalon soit réellement considérée comme étroite et acceptable pour une utilisation dans le cadre d’un étalonnage GPC, la dispersité doit en effet être < 1,10. Il est également possible d’effectuer un étalonnage par étalons larges, et la procédure d’étalonnage universel de Benoit (avec ou sans viscosimètre en ligne) peut également être utilisée. Nous allons détailler chacune de ces méthodes.

Étalonnage relatif par étalons étroits

La technique classique d’étalonnage par étalons étroits est un étalonnage relatif car les masses moléculaires moyennes obtenues dépendent de l’étalon. Par exemple, si le polyéthylène est utilisé comme échantillon, et que le jeu de colonnes a été étalonné avec des étalons étroits de polystyrène, les masses moléculaires obtenues après intégration seront incohérentes pour le polyéthylène, car basées sur le polystyrène. Cependant, cela convient à de nombreuses personnes qui comparent simplement les masses moléculaires obtenues pour un élément inconnu à un ensemble de valeurs « acceptables ». Il n’est pas important que ces valeurs de masses moléculaires soient ou non réellement « absolues » pour leur polymère d’intérêt, tant que ces valeurs obtenues sont incluses dans la plage acceptable.

Il existe plusieurs autres étalons étroits disponibles pour la GPC en phase organique, tels que les poly(méthacrylates de méthyle), les polyisoprènes, les polybutadiènes, le poly(THF), mais le polystyrène est certainement le principal étalon étroit utilisé pour l’analyse GPC en phase organique. Dans le cas de la GPC en phase aqueuse, les poly(oxydes d’éthylène) sont les plus utilisés, au même titre que les poly(éthylène glycols) pour les masses moléculaires basses, et les pullulanes, qui sont des polysaccharides à base de structures trioses. Après avoir analysé la série d’étalons étroits, un ajustement polynomial (généralement de troisième ou cinquième ordre) est ensuite réalisé et la courbe d’étalonnage log M en fonction du temps de rétention (ou du volume) correspondante est tracée.

Étalonnage par étalons larges

Il est également possible d’étalonner le jeu de colonnes GPC avec un étalon large. Il s’agit du même polymère, analysé en tant qu’inconnu. L’étalon large peut être acheté auprès de différents fournisseurs. L’étalon doit être bien caractérisé. Cela signifie que les masses moléculaires moyennes en nombre, en poids, Z et éventuellement de viscosité ont été déterminées par d’autres méthodes (osmométrie membranaire, diffusion de lumière ou ultracentrifugation, par exemple). Une autre méthode impliquerait l’utilisation d’un échantillon de matière « réel » (présent en quantité significative), dont les masses moléculaires moyennes ont été déterminées par ces autres techniques. L’avantage est de pouvoir utiliser un polymère qui a la même structure que les échantillons inconnus analysés jour après jour.

Les moyennes des masses moléculaires connues sont saisies dans le logiciel, et l’étalon large est chromatographié de la manière habituelle, dans les mêmes conditions que pour les éléments inconnus. Le logiciel effectue une recherche par simplex en ajustant le profil de l’étalon large chromatographié aux masses moléculaires moyennes renseignées. La courbe d’étalonnage ainsi obtenue comportera les points de données pour chaque moyenne. Si vous ne fournissez que des moyennes en nombre et en poids, la courbe d’étalonnage résultante comportera trois points : ces deux points, plus la masse moléculaire du pic. Cet étalon large est basé sur les travaux effectués par Hamielec en 1969. Il est recommandé d’utiliser deux étalons larges de masse moléculaire différente pour élargir la plage de masses moléculaires de la courbe d’étalonnage. Même en utilisant deux étalons larges dont les masses moléculaires moyennes sont connues, seule une courbe d’étalonnage à six points peut être obtenue, par exploitation des valeurs de masse moléculaire de pics résultant de la routine de recherche. Cependant, pour un laboratoire de contrôle qualité qui analyse quotidiennement le même polymère, dans la même plage de masses moléculaires que les étalons larges, cette technique fonctionne très bien et permet d’obtenir des masses moléculaires absolues.

Il existe plusieurs autres étalons étroits disponibles pour la GPC en phase organique, tels que les poly(méthacrylates de méthyle), les polyisoprènes, les polybutadiènes, le poly(THF), mais le polystyrène est certainement le principal étalon étroit utilisé pour l’analyse GPC en phase organique. Dans le cas de la GPC en phase aqueuse, les poly(oxydes d’éthylène) sont les plus utilisés, au même titre que les poly(éthylène glycols) pour les masses moléculaires basses, et les pullulanes, qui sont des polysaccharides à base de structures trioses. Après avoir analysé la série d’étalons étroits, un ajustement polynomial (généralement de troisième ou cinquième ordre) est ensuite réalisé et la courbe d’étalonnage log M en fonction du temps de rétention (ou du volume) correspondante est tracée.

Étalonnage universel

Le concept d’étalonnage universel a été introduit par Benoit, et. al. en 1967. Au lieu de tracer le log de la masse moléculaire d’une série d’étalons étroits en fonction de la rétention, le log du produit de la viscosité intrinsèque [η] par la masse moléculaire M est tracé en fonction de la rétention. Le produit [h]M est appelé volume hydrodynamique. Benoit a découvert que le tracé de valeurs de volume hydrodynamique de différents étalons étroits permettait d’obtenir une courbe d’étalonnage unique. En d’autres termes, tous les points appartiennent à la même courbe. Une fois cet étalonnage « universel » obtenu, tout polymère conformé en pelote aléatoire peut être analysé dans le solvant adéquat, et sa masse moléculaire déterminée avec la courbe universelle. Benoit a utilisé un viscosimètre à capillaire en verre pour mesurer les viscosités des étalons étroits et des échantillons. Après la génération de la courbe universelle, nous pouvons également tracer le log de la viscosité intrinsèque en fonction du log de la masse moléculaire pour les étalons étroits. Cette courbe est appelée courbe de viscosité, ou courbe de Mark-Houwink. La pente de cette courbe est alpha (parfois dénommée α), et l’ordonnée à l’origine est appelée log K. L’équation ainsi obtenue, connue sous le nom d’équation de Mark-Houwink, est la suivante :

Vous trouverez dans le « Polymer Handbook » les nombreuses valeurs K et alpha pour différentes combinaisons de polymère et de solvant. Il est possible de saisir ces constantes empiriques dans de nombreux logiciels de GPC disponibles aujourd’hui dans le commerce, et d’obtenir des masses moléculaires « absolues », ou exactes, pour de nombreux polymères. Vérifiez toutefois que les valeurs du Handbook sont exactes pour le polymère à analyser, au risque d’obtenir des résultat erronés. 

À l’heure actuelle, nous pouvons utiliser un viscosimètre en ligne ainsi qu’un détecteur d’indice de réfraction différentiel (dRI) pour générer directement la masse moléculaire de chaque tranche. Le dRI détecte de concentration (C), tandis que le viscosimètre indique le produit de la viscosité intrinsèque par la concentration ([η]C). En divisant le signal du viscosimètre par le signal dRI, on obtient la viscosité intrinsèque [n i] de chaque tranche à travers le pic du polymère. Nous connaissons maintenant à la fois la viscosité intrinsèque et, bien sûr, le temps de rétention (ou volume) de chaque tranche. Nous pouvons donc revenir à la courbe d’étalonnage universel pour dégager la masse moléculaire de chaque tranche, Mi. Ce concept d’étalonnage universel est largement applicable, en particulier pour les polymères de type pelote aléatoire, qui représentent la majorité des polymères analysés aujourd’hui. D’autres conformations de polymères, telles que les bâtonnets, les sphères ou les globes (comme les protéines), peuvent ne pas convenir aux concepts universels. Il ne doit pas y avoir d’interaction entre le polymère et l’éluant ou le matériau de remplissage de la colonne pour que l’étalonnage universel fonctionne.  

Un autre avantage à utiliser l’étalonnage universel et la viscosimétrie/détection dRI en ligne repose sur la possibilité de déterminer le degré de ramification d’un polymère par rapport à un étalon polymère linéaire connu. Cette technique est assez sensible à la ramification à longue chaîne (par opposition à la ramification à chaîne courte) et aide à prédire la façon dont un certain polymère sera traité, ou ses propriétés physiques finales, par rapport à son équivalent linéaire. 

À titre d’exemple, il est possible d’analyser un polymère large de polyéthylène linéaire (tel que le « NBS 1475 » ou tout autre polyéthylène linéaire connu), en utilisant les valeurs de Mark-Houwink résultant de l’expérience. La courbe de Mark-Houwink (ou courbe de viscosité) ainsi obtenue sera linéaire, avec une pente constante (valeur alpha constante sur toute la distribution des masses moléculaires). Les valeurs K et alpha peuvent alors être saisies dans le logiciel, et tous les polyéthylènes inconnus ultérieurs peuvent être analysés en comparant la courbe de viscosité à celle du polyéthylène linéaire connu.

Si l’élément inconnu présente des ramifications à longue chaîne, la relation viscosité/masse moléculaire n’est pas linéaire. Cela signifie que la viscosité n’augmentera pas linéairement avec la masse moléculaire. Plus l’écart par rapport à la linéarité est prononcé, plus le niveau de ramification à longue chaîne est important. Une valeur alpha exacte peut être obtenue pour un polymère ramifié uniquement à des masses moléculaires basses, où il n’existe pas de ramification à longue chaîne et où la pente est constante. Si le polymère présente une masse moléculaire associée à une ramification à longue chaîne, la valeur alpha change en permanence (elle peut même s’approcher de zéro) et n’a plus de sens. Un simple rapport entre la courbe de viscosité du polymère ramifié et le polymère linéaire permet d’obtenir l’indice de ramification (g’), où : g’ = [η ]br/[η]lin. D’autres calculs sont possibles pour déterminer la fréquence de ramification, le type de ramification présent, etc. Il est évident que l’ajout d’un viscosimètre en ligne à un détecteur d’indice de réfraction peut fournir beaucoup plus d’informations sur votre polymère, en particulier :

• les masses moléculaires « absolues » ou exactes du polymère via l’étalonnage universel,
• le calcul de la viscosité intrinsèque du polymère,
• la détermination de la ramification.

Réalisation d’une analyse GPC

Le critère le plus important lors de la préparation d’une analyse GPC consiste à identifier un solvant adapté pour dissoudre le polymère. Cela peut paraître anodin, mais n’oubliez pas que la GPC est une technique de séparation basée sur la taille du polymère en solution. Les chaînes de polymères vont s’ouvrir jusqu’à prendre une certaine conformation relâchée en solution, et le solvant choisi permettra de déterminer cette taille. De nombreux polymères sont solubles à température ambiante dans divers solvants. Mais dans certains cas (en particulier pour les polymères hautement cristallins), une température élevée est nécessaire pour leur dissolution. Un autre aspect important de la préparation des échantillons pour GPC est la concentration choisie. Si la capacité de charge de l’échantillon sur le jeu de colonnes est trop élevée, des effets sur la concentration ou la viscosité peuvent se produire, entraînant des volumes d’élution incorrects. Un autre élément à prendre en compte repose sur la filtration ou non de la solution polymère. Nous allons aborder certaines de ces considérations en matière de préparation des échantillons.

Notez que dans de nombreux cas où apparaît le nitrate de sodium, beaucoup d’utilisateurs ont utilisé de l’acétate, du sulfate, du chlorure de sodium, etc. Nous recommandons le nitrate de sodium, qui permet de réduire au minimum les interférences ioniques de façon très constante pour les composés neutres et anioniques. La raison est, pour ces éluants, la charge anionique globale du matériau de remplissage. Un gel de garnissage à base de méthacrylate pour une GPC en phase aqueuse présente une charge anionique globale qui peut entraîner une exclusion ionique pour les échantillons anioniques, et une adsorption ionique pour les échantillons cationiques s’ils sont analysés uniquement dans de l’eau. 

Il convient de toujours filtrer l’éluant sous vide avant utilisation dans le système chromatographique. Avec les solvants organiques, un filtre fluorocarboné est généralement utilisé. La taille de la membrane des pores du filtre est généralement de 0,45 µm (micron). Pour la GPC en phase aqueuse (filtration de l’eau), un filtre à membrane de type acétate est utilisé. Pour une analyse par diffusion de lumière, il peut être judicieux de filtrer l’éluant à travers un filtre de 0,20 µm. Certains solvants organiques tels que le DMF sont très visqueux et ne mouillent pas très bien la surface du filtre fluorocarboné. Une astuce consiste à humidifier d’abord la surface du filtre avec du méthanol, puis à démarrer rapidement la filtration au DMF. Vous devez ensuite jeter ce petit volume de mélange méthanol/DMF, puis démarrer la filtration au DMF avant que le filtre ne sèche.

Concentration

Une fois le bon solvant choisi pour l’analyse, l’étape suivante consiste à préparer l’étalon étroit et les solutions d’échantillons. Il convient de veiller à utiliser une concentration suffisante pour obtenir un rapport signal/bruit acceptable, mais sans risquer toutefois de surcharger la colonne et de compromettre la concentration. Le tableau ci-dessous est une « règle empirique » générale à utiliser pour déterminer la concentration à préparer. Ces concentrations sont exprimées en pourcentage, où 1,0 mg/mL équivaut à 0,10 %. Aucune correction n’étant effectuée pour la température, tout est supposé avoir été préparé à température ambiante. Souvenez-vous que si vous effectuez une analyse par viscosimétrie ou par diffusion de lumière, la masse exacte injectée doit être déterminée. Cela nécessitera des corrections au niveau de la densité si l’analyse est réalisée à température élevée. Les concentrations indiquées ci-dessous reposent sur un volume d’injection maximal de 100 µL par colonne. 

Préparation de l’échantillon

Maintenant que nous avons dissous avec succès les étalons et les échantillons dans le solvant choisi, installé nos colonnes GPC, nous sommes prêts à commencer les injections. La prochaine décision à prendre concerne la filtration ou non de solution d’échantillon. Dans quasiment tous les cas, il convient de filtrer la solution d’échantillon avant l’injection.  

En général, comme pour la filtration des solvants évoquée précédemment, nous choisirons un filtre fluorocarboné d’une membrane de 0,45 µm. Dans certains cas, en présence de particules très fines (comme du noir de carbone, du dioxyde de titane, de la silice ou d’autres matières de charge), un filtre de 0,20 µm peut être utilisé.  

Bien évidemment, si nous commençons à utiliser des filtres de très petite taille, le cisaillement du polymère peut devenir un problème. La filtration d’un polymère de masse moléculaire élevée à travers un filtre de 0,20 µm risque en effet d’entraîner une dégradation par cisaillement. Il se peut que décision soit prise de ne pas filtrer du tout l’échantillon, en espérant que la pression n’augmente pas en raison d’une obstruction du filtre intégré du système ou du fritté de la colonne.  

Nous pouvons maintenant commencer à injecter les étalons et les échantillons. Comme mentionné précédemment, nous injecterons un maximum de 100 µL par colonne, aux concentrations indiquées dans le tableau. Le temps d’analyse sera d’environ 15 minutes par colonne à un débit de 1,0 mL/min. La durée d’analyse pour un jeu de trois colonnes avoisinera donc 45 min.  

Une fois le jeu d’échantillons analysé, il est temps pour le système de traitement des données de traiter les résultats conformément à la méthode d’intégration conçue et de générer un rapport complété. Cela peut être fait automatiquement via le mode « Run and Report » (Analyser et créer un rapport) du logiciel Empower. Il est également possible d’accéder à chaque fichier de données brutes et d’intégrer manuellement chaque échantillon.