Manuel d’introduction à la SFC préparative

Criblage de la colonne :

Avant de pouvoir isoler un composé cible par chromatographie, il est nécessaire de mettre au point une méthode. Cette opération est généralement effectuée à l'échelle analytique afin d'économiser du solvant, du temps et de l'échantillon. En SFC, la rétention de composants individuels d’un mélange sur une phase stationnaire définie ne peut pas être prédite. Contrairement à la RPLC, l'identification de la bonne chimie de colonne est essentielle pour les séparations de SFC et constitue le facteur le plus important dans le développement de méthodes de SFC. Il est donc important de s’appuyer sur une stratégie de criblage efficace pour maximiser la qualité de la séparation en fonction de la ou des cibles de la purification. Le développement en phase stationnaire est actuellement très dynamique et un petit nombre de chimies pourraient devenir les colonnes préférées à l’avenir. À l'heure actuelle, la plupart des utilisateurs adaptent un processus de criblage automatisé en utilisant les colonnes qui correspondent au mieux à leur application.

Plusieurs facteurs doivent être pris en compte pour déterminer un jeu de colonnes approprié pour le criblage. Le rapport L/dp (longueur/taille des particules) doit être maintenu entre la colonne analytique et l'éventuelle colonne préparative, seules des colonnes analytiques de taille appropriée devraient donc être prises en compte. Ceci garantit la continuité de la chromatographie entre les systèmes lors de la mise à l'échelle. Les colonnes doivent présenter une large plage de sélectivité et être adaptées à la nature de l’échantillon. Par exemple, les composés hautement polaires (comme les glucides) ne sont probablement pas retenus sur une colonne en C₁₈, tandis qu’une colonne de silice n’est probablement pas optimale pour les composés extrêmement hydrophobes (non polaires, comme la plupart des caroténoïdes). Les colonnes peuvent également être classées en fonction de leur aptitude à recevoir des composés basiques ou acides, ou les deux.

Pour la purification chirale, des colonnes chirales sont nécessaires. En raison de l’interaction plus complexe de la phase stationnaire avec les composés cibles, davantage de tests sont nécessaires pour déterminer la meilleure colonne pour les séparations chirales. Cependant, certaines colonnes ont un taux de réussite plus élevé que d’autres. Par exemple, les phases chirales dérivées de cellulose et d'amylose sont appréciées pour leur large gamme d'applications, tandis que d'autres phases chirales, telles que les phases de type Pirkle, sont appréciées pour leur stabilité chimique élevée. Les phases chirales peuvent également être utilisées avec succès pour des applications achirales, en particulier avec des isomères de position ou des composés étroitement apparentés.

Le criblage de la colonne est généralement effectué dans des conditions de gradient du solvant, généralement entre 2 et 50 % de cosolvant. Ces conditions donnent à l’utilisateur une bonne idée de la colonne optimale pour isoler le composé cible, tout en fournissant une bonne indication des pourcentages de cosolvant nécessaires à l’élution du composé. La Figure 14 est un exemple de criblage sur colonne chirale pour la séparation de la (R) et de la (S)-goitrine (un produit naturel actif présent dans la racine d’Isatis Indigotica Fort), avec utilisation de cinq phases stationnaires à base de cellulose et d’amylose (IC, OJ-H, AS-H, OD-H et AD-H), et une phase stationnaire de type Pirkle (S/S)-Whelk-O 1.16. Un exemple de criblage sur colonne achirale est illustré à la Figure 15, où un mélange de trois caroténoïdes est criblé sur quatre phases stationnaires achirales.17 Notez que les caroténoïdes sont mieux retenus sur la phase C₁₈, et non sur les autres phases plus polaires.

Criblage des solvants

Le CO₂ seul est généralement insuffisant pour éluer les composés à partir d’une colonne chromatographique, c'est pourquoi, un cosolvant polaire est généralement ajouté. La sélection des cosolvants est un paramètre clé dans le développement et l’optimisation des méthodes chromatographiques de SFC. Pour la plupart des applications, une large gamme de cosolvants et de mélanges peut être appliquée pour optimiser la séparation. La gamme de solvants compatibles en SFC peut sembler importante, mais elle peut être simplifiée en associant les deux extrémités du spectre de polarité : du CO₂ non polaire avec des solvants organiques hautement polaires. Cela permet d’obtenir une phase mobile couvrant une large gamme de solvants.

Les quatre cosolvants les plus courants sont le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol et l'acétonitrile ; le méthanol ayant la polarité la plus forte et l’acétonitrile la plus faible. Il est généralement recommandé d’utiliser du méthanol ou de l’éthanol pour le criblage de la colonne et le criblage du solvant initial. L'isopropanol et l'acétonitrile sont utiles pour l'optimisation de la méthode ou dans les cas où l'éthanol ou le méthanol ne permettent pas d'obtenir une résolution acceptable. Souvent, des combinaisons de ces solvants peuvent affiner la polarité de la phase mobile. Par exemple, l'ajout d'acétonitrile à l'éthanol affaiblit le cosolvant, ce qui augmente la rétention et offre une sélectivité différente. En général, lorsque la force du cosolvant diminue, la rétention augmente. Comme en LC, la rétention diminue à mesure que la proportion de solvant fort augmente (Figure 16). Cependant, en raison de la faible viscosité du CO₂, le débit total peut parfois être augmenté (pour le même pourcentage de cosolvant), ce qui accélère la durée d’analyse tout en maintenant la séparation (Figure 17).

Additifs dans le cosolvant

Des pics plus nets et une meilleure résolution sont importants en chromatographie préparative, où des pics larges et une faible solubilité peuvent avoir des conséquences désastreuses sur la productivité. La traînée de pics en SFC peut être supprimée par l’utilisation d’additifs dans la partie cosolvant de la phase mobile, ce qui étend la gamme de solutés pouvant être traités par une phase mobile à base de CO₂.

L'utilisation du CO₂ comme solvant chromatographique produit une phase mobile légèrement acide lorsqu'il est associé à d'autres solvants organiques polaires. Puisqu’une phase mobile à base de CO₂ est légèrement acide, de nombreux composés acides et neutres présentent des formes de pic acceptables sans qu’un additif de phase mobile soit nécessaire. Cependant, les additifs acides peuvent améliorer la forme des pics de certains composés acides (Figure 18). Les additifs acides courants incluent l’acide trifluoroacétique, l’acide formique et l’acide acétique. Les applications contenant des composés basiques nécessitent généralement un additif basique (généralement entre 0,1 et 1 %) pour améliorer la chromatographie (Figure 19). Les additifs basiques courants sont des amines secondaires ou tertiaires telles que l’isopropylamine (IPA), la diéthylamine (DEA) ou la triéthylamine (TEA). Ces additifs sont extrêmement efficaces, même à de très faibles concentrations (jusqu’à 0,01 % dans le cosolvant). Ils peuvent toutefois interférer avec la détection par MS et présenter des effets de mémoire sur certaines chimies de colonne (en particulier la silice nue). Par conséquent, l'acétate d'ammonium et l'hydroxyde d'ammonium sont également utilisés, car ils sont plus adaptés aux colonnes et au spectromètre de masse, et peuvent même améliorer le signal de ce dernier.

En plus des cosolvants classiques, de nombreuses nouvelles colonnes sont compatibles avec des cosolvants ou des additifs non classiques, notamment l’acétate d’éthyle, le tétrahydrofurane, le dichlorométhane, le chloroforme ou le diméthoxyméthane. Ces combinaisons permettent de moduler davantage les temps de rétention et la sélectivité, tout en améliorant la solubilité des échantillons. L’eau est un additif non classique qui gagne en popularité. L'eau n'est pas miscible avec le CO₂. Cependant, lorsqu'elle est utilisée comme additif dans un cosolvant fortement polaire (comme le méthanol), l'eau devient un excellent choix pour augmenter la solubilité et la forme des pics des composés hydrophiles dans la SFC. La quantité d'eau pouvant être tolérée dépend de la proportion de cosolvant dans la phase mobile totale. Finalement, un bruit de la ligne de base sera observé en raison de la séparation des phases (immiscibilité) dans la phase mobile. En général, 1 à 5 % d’eau peuvent être utilisés efficacement dans le cosolvant polaire. Avec de l’eau comme additif, les composés plus fortement polaires peuvent être purifiés par Prep SFC.

À des fins de purification, il est préférable d’éviter d’utiliser des additifs qui devront être éliminés en aval. Si des additifs sont nécessaires pour la séparation, des additifs volatils pouvant être facilement éliminés devraient être utilisés avec la plus faible concentration effective. Sinon, il existe désormais de nouvelles phases stationnaires qui réduisent le besoin d’additifs, ce qui offre un avantage significatif à la Prep SFC.

La solubilité et le facteur de rétention de tous les composés sont étroitement liés à la densité du fluide.

La densité de la phase mobile le long de la colonne est très importante, car elle contrôle les propriétés physiques et chimiques de la phase mobile. Une caractéristique intéressante de la SFC est la possibilité de contrôler la densité de la phase mobile grâce à la température et la pression. Alors que le choix de la colonne et de la phase mobile a le plus grand impact sur la séparation dans la SFC, la température et la pression sont utilisées pour affiner ou optimiser une séparation. Entre ces deux paramètres, la pression a la plus grande influence sur la chromatographie : la densité augmente en même temps que la pression, entraînant généralement une réduction du temps de rétention et de résolution (Figure 20). En revanche, des températures plus élevées entraînent une densité plus faible et des temps de rétention plus longs. Cependant, avec la température, l’effet dépend du composé et peut entraîner un changement de résolution, voire un changement dans l’ordre d’élution pour les composés dont l'élution est proche ; ceci a été observé plus fréquemment pour les séparations chirales (Figure 21).

La pression est controlée à l’aide d’un régulateur de contre-pression (BPR) qui règle la « pression arrière » du système en aval de la colonne. Bien que les systèmes soient conçus pour une large gamme de pressions (jusqu’à des points de consigne de 400 bar), en Prep SFC, le régulateur de contre-pression est généralement réglé entre 100 et 200 bar, soit entre 1450 et 2901 psi. Les températures sont contrôlées par des points de consigne utilisant un four (qui chauffe la colonne) ou des échangeurs de chaleur (qui chauffent la phase mobile).

Les points de consigne de température typiques se situent entre 40 et 60 °C. Certaines applications sont exécutées dans des conditions sous-critiques (CO₂ liquide), dans lesquelles les températures sont réglées entre 25 et 35 °C, tandis qu'une pression relativement élevée est maintenue. Il n’est pas recommandé d’opérer à des pressions et des températures proches du point critique car, dans ces conditions, de faibles variations de température ou de pression entraînent des variations importantes de densité (et de chromatographie). Les limites de température et de pression sont généralement liées à la robustesse de la chimie ou de la garniture de la colonne.

Optimisation des conditions de la phase mobile

Le choix de la combinaison optimale de solvant et de colonne dépend généralement de l’application ou de l'objectif. Dans un scénario parfait, un chargement élevé, une bonne résolution et une séparation rapide se combinent pour assurer une récupération complète de la cible à une pureté élevée. Mais en réalité, un compromis est généralement nécessaire pour déterminer la solution la plus efficace. Par exemple, les pics peuvent être bien séparés (permettant une charge élevée), mais nécessitent une durée d'analyse plus longue. En revanche, une bonne séparation avec un temps d’analyse significativement plus court permettrait un temps de cycle plus court, mais éventuellement avec un chargement plus faible. Un autre élément à prendre en compte est le traitement en aval ou la récupération des fractions, où la quantité ou le type de solvant peut être un facteur important. Enfin, si la séparation peut être réalisée dans des conditions isocratiques, des injections empilées peuvent être réalisées, ce qui améliore considérablement la productivité. Une fois la colonne et le solvant sélectionnés, d’autres paramètres peuvent être manipulés pour mieux optimiser la séparation avant l’extrapolation et la purification.

Optimisation des conditions de gradient : en SFC, les gradients ciblés ne fonctionnent pas de la même manière qu'en RPLC. En raison des nombreux mécanismes de rétention concurrents en chromatographie en phase normale, des modifications du gradient peuvent avoir des effets disparates sur la rétention de différents analytes. Dans le cas de la SFC en particulier, un changement de densité et une chute de pression accompagnent également l’augmentation du cosolvant à travers le gradient. À mesure que la quantité de cosolvant augmente, l’effet sur le temps de rétention n’est pas linéaire, ce qui rend difficile de prédire la sélectivité des composés en fonction des différentes conditions. Pour les composés structurellement similaires, cela pose moins de problèmes, car ils obéissent à des mécanismes de rétention similaires. Les échantillons contenant des mélanges de composés structurellement différents (dans une matrice, par exemple) posent plus de difficultés. Mais en général, des gradients en pente plus douce entraînent des temps de rétention plus longs et une meilleure résolution.

Détermination des conditions isocratiques : les méthodes isocratiques sont idéales, car elles sont faciles à développer sur la base des résultats du criblage, et des injections empilées peuvent être utilisées, ce qui améliore la productivité. Les pourcentages de cosolvant à l’élution peuvent être déterminés grâce au temps de rétention et à la pente du gradient de criblage, et en compensant le délai volumique du système et de la colonne. En SFC, le meilleur point de départ pour l’optimisation se situe généralement 5 % en dessous du pourcentage calculé.

Le gradient de criblage était de 2 à 20 % sur 5 minutes et le retard du gradient était de 0,46 min (déterminé précédemment). Ainsi, avec une pente calculée de 3,6 %/min et un pourcentage de départ de 2 %, le pourcentage de cosolvant à l’élution du premier pic à 4,12 minutes a été calculé à l’aide de l’équation suivante :

■ Pourcentage de cosolvant à l'élution = (temps de rétention – délai de gradient) x pente du gradient + % de départ

■ Pourcentage de cosolvant à l'élution = (4,12 min–0,46 min) x 3,6 %/min + 2 %

■ Pourcentage de cosolvant à l'élution = 15 %

Par conséquent, après soustraction de 5 %, des conditions de cosolvant isocratiques de 10 % ont été utilisées comme point de départ pour l’optimisation. La chromatographie résultante montrait une bonne séparation. Cependant, en augmentant la fraction de cosolvant de la phase mobile à 15 %, les pics étaient toujours bien résolus avec un temps d’analyse plus court. Dans ce cas, la méthode à 10 % permet un chargement plus important, tandis que la méthode à 15 % permet des temps de cycle plus courts.

Échelle du système

Pour la Prep SFC, des instruments capables de fonctionner à des débits allant de 2 mL/min à plusieurs centaines de mL/min sont disponibles pour répondre aux exigences de fonctionnement à différentes échelles. Dans une procédure adéquate, l’échelle de la purification doit correspondre à l’objectif de l’application. Ceci est particulièrement important lorsque l'échantillon est limité ou peu soluble. Dans ce cas, un système de purification à plus petite échelle (semi-préparative) est plus pratique. En SFC, les purifications à petite échelle sont généralement effectuées sur des colonnes de diamètre intérieur de 4,6 à 10 mm, à des débits de 3 à 20 mL/min. Un tableau associant la taille des colonnes aux débits et à la capacité de charge approximative en Prep SFC est présenté ci-dessous (Tableau 5). Il est important de noter que la capacité de chargement d'un échantillon donné dépend de nombreux facteurs, notamment la solubilité, la résolution de la cible et la quantité relative du composé cible par rapport à la matrice.

Les systèmes de Prep SFC à plus grande échelle utilisent des colonnes de diamètre intérieur de 18 à 50 mm, avec des débits allant de 50 à 350 mL/min. La plus grande capacité de colonne permet un plus grand chargement par injection et des débits plus importants, ce qui optimise le rendement pour ces applications. Dans le domaine de la purification, ces systèmes sont considérés comme étant de taille moyenne. Les systèmes de Prep SFC à grande échelle pilote (non abordés ici) sont utilisés dans de nombreux processus industriels établis. Ceux-ci utilisent de très grandes (30 cm de diamètre intérieur ou plus) colonnes de chromatographie à compression axiale dynamique (DAC) haute pression, et sont généralement utilisés comme des installations d’usine.

Procédures : en masse ou en lot

En fonction de l’application, la Prep SFC peut être réalisée selon deux procédures différentes. Le premier est appelé purification en masse. Au cours de cette procédure, un seul échantillon, en grande quantité, est injecté plusieurs fois jusqu'à ce que la quantité requise de la ou des cibles soit récupérée, ou jusqu'à épuisement de l'échantillon. Toutes les fractions collectées correspondantes sont regroupées dans l’un des flacons de collecte, dont le nombre est limité. Les quantités en masse de matériau sont traitées et récupérées sur plusieurs heures (ou parfois plusieurs jours). Il s’agit généralement d’une purification assistée par la détection UV, bien que d’autres méthodes de détection puissent être utilisées. Dans ce cas, les échantillons sont généralement bien caractérisés et compris, et l’objectif est d’atteindre une productivité élevée.

Pour de nombreuses applications en masse, des injections empilées sont utilisées. Les injections empilées améliorent considérablement le rendement en utilisant tout l’espace chromatographique disponible pour une séparation et une purification en continu. Les injections empilées réduisent le temps entre les cycles d’injection et minimisent encore plus l’utilisation de solvant. La figure 22 présente un exemple d’injections empilées. Dans certaines applications, plusieurs injections peuvent être effectuées avant que la première série de pics ne soit éluée. Pour pouvoir utiliser des injections empilées, le système doit pouvoir injecter pendant les collectes. Par conséquent, un module d'injection séparé ou un système capable de déplacer de manière autonome les éléments de collecte et d'injection (aiguilles et sondes) est utilisé.

La purification par en masse fait référence à un processus plus pratique pour la purification de bibliothèques, ou lorsque plusieurs échantillons avec plusieurs cibles doivent être purifiés. En général, la purification assistée par la détection de masse est utilisée, car elle est plus sélective lors de la collecte des fractions. Avec la purification assistée par détection optique (ou UV), les pics ne peuvent pas être distingués les uns des autres par le détecteur. De nombreux composés absorbent à la même longueur d’onde. La purification assistée par la détection de masse recueille les fractions en fonction de la masse, ce qui est un paramètre beaucoup plus spécifique car elle permet de faire la distinction entre la ou les cibles et les impuretés éventuelles. Celle-ci est particulièrement utile lorsque les échantillons ont des matrices complexes, qu’ils ne sont pas bien caractérisés, ou qu’ils ne peuvent pas être détectés par UV car ils ne contiennent pas de chromophores. En général, les méthodes du gradient sont utilisées pour améliorer la forme des pics et mieux séparer les composés des interférences complexes. Ce processus requiert un système de collecte à lit ouvert dans plusieurs tubes. En général, chaque tube constitue une fraction unique. Les échantillons sont traités en tant que lot et les composés cibles sont recueillis en fonction de leurs masses. La purification par lots peut également être effectuée à l’aide de déclencheurs UV uniquement ou de déclencheurs UV et MS. Un exemple de purification par MS de composés cibles à partir de produits naturels est illustré à la figure 23.