Manuel d’introduction à l’UPLC

Si l’on considère la résolution chromatographique au sens le plus simple du terme, il s’agit simplement de la largeur [w] de deux pics par rapport à la distance [t_R,2–t_R,1] entre ces pics. Si nous pouvons rétrécir ou éloigner ces pics, nous pouvons améliorer la résolution.

La résolution peut être exprimée mathématiquement en des termes plus pertinents sous la forme de l’équation de résolution fondamentale. L’équation de résolution est composée de paramètres physiques et chimiques qui affectent la résolution chromatographique, l’efficacité [N], la sélectivité [α] et la rétention [k]. La sélectivité et la rétention sont des facteurs chimiques historiquement plus faciles à manipuler pour améliorer la résolution. Ces paramètres peuvent être affectés par des variations telles que la température, le solvant d’élution, la composition de la phase mobile et la chimie de colonnes. L’efficacité est un paramètre physique [mécanique] qui est plus difficile à manipuler en raison de son influence quadratique sur la résolution. Cependant, l’efficacité peut avoir un impact significatif sur la résolution si la granulométrie est très faible. La technologie UPLC se concentre sur l’amélioration de la résolution en utilisant des particules inférieures à 2 µm pour améliorer l’efficacité du système.

Il est plus facile de comprendre comment ces paramètres affectent la résolution si l’on réfléchit pense à la façon dont ces trois termes sont représentés chromatographiquement [Figure 15]. La rétention [k] et la sélectivité [α] sont des facteurs chimiques qui déplacent les pics les uns par rapport aux autres et qui mesurent l’interaction des analytes avec la phase stationnaire et la phase mobile. Nous pouvons améliorer la résolution en augmentant la valeur k. Cependant, il en résulte des temps de rétention plus longs, une sensibilité plus faible et des largeurs de pic plus importantes. Une augmentation de la valeur α peut entraîner une meilleure résolution, le même ordre d’élution des pics en un temps similaire et/ou un changement d’ordre d’élution. L’efficacité [N] est une mesure physique de l’étalement des bandes dans une séparation. En supposant que N est améliorée par la réduction de la granulométrie du matériau de remplissageconditionnement, la distance entre les centres des pics ne change pas. De plusEn outre, une réduction de la granulométrie produira des pics chromatographiques plus étroits et plus efficaces, améliorant ainsi la résolution et la sensibilité.

Relation entre la résolution, l’efficacité et la granulométrie

La technologie UPLC maximise la contribution physique [mécanique] apportée à la résolution en réduisant l’étalement des bandes de l’instrument, ce qui permet d’utiliser des colonnes à plus grande efficacité et à faible granulométrie [1,7 µm – 1,8 µm]. Des exemples chromatographiques simples et une arithmétique basique permettent de mieux comprendre les principes chromatographiques à la base de la technologie UPLC.

Comme indiqué dans l’équation de résolution fondamentale, la résolution est directement proportionnelle à la racine carrée de l’efficacité.

De plusEn outre, l’efficacité est inversement proportionnelle à la granulométrie. Cela signifie que si la granulométrie du matériau de remplissageconditionnement est réduite, l’efficacité de séparation augmente. Par exemple, si la granulométrie du matériau de remplissageconditionnement diminue de 5 µm à 1,7 µm [3x], la théorie prédit que l’efficacité devrait augmenter de 3x, entraînant une augmentation de 1,7x de la résolution [racine carrée de 3].

Pour obtenir les gains d’efficacité et de résolution prévus par la théorie, le débit optimal doit être utilisé en fonction de la granulométrie. Le débit optimal [F_opt] est inversement proportionnel à la granulométrie. Cela signifie que si la granulométrie diminue de 5 µm à 1,7 µm [3x], le débit optimal pour analyser cette particule augmente de 3x, entraînant une réduction du temps d’analyse d’autant [3x], augmentant ainsi la vitesse d’analyse des échantillons.

L’une des premières choses que nous observonsqu'on observe en tant que chromatographistes est ce qui se passe lorsque le débit chromatographique est modifié. Si le débit augmente, le temps d’analyse diminue. De plusEn outre, la largeur du pic diminue également. À mesure que la largeur du pic diminue, la hauteur de ce pic augmente proportionnellement. Les pics plus étroits et plus hauts sont plus faciles à détecter et à différencier du bruit de la ligne de base [S/B plus élevé], ce qui entraîne une sensibilité plus élevée.

Ces principes théoriques ont été appliqués par chromatographie. Comme le montre la figure 20, lorsque l’étalement des bandes extra-colonne est réduit comme dans l’instrument ACQUITY UPLC, les performances théoriques d’une colonne peuvent être obtenues.

La discussion ci-dessus démontre l’importance de l’étalement des bandes intra-colonne. Si l’on peut mieux comprendre quels procédés influencent l’étalement des bandes et comment le réduire, on peut améliorer l’efficacité et par conséquent la résolution.

Comprendre les courbes de van Deemter

Comme décrit précédemment, la largeur d’un pic peut être considérée comme une distribution statistique des molécules d’analytes [variance, σ²]. La largeur du pic augmente linéairement proportionnellement à la distance parcourue par ce pic. La relation entre la largeur du pic et la distance parcourue par ce pic est un concept appelé hauteur équivalente à un plateau théorique [HETP ou H]. Trouvant son origine dans la théorie de la distillation, H est une mesure des performances de la colonne qui prend en compte plusieurs procédés liés à l’étalement des bandes. Pour utiliser des termes qui sont peut-être plus familiers, plus la valeur HETP est petite, plus il y a de plateaux [N] dans une colonne [Figure 21].

Si nous réfléchissons pensons à ce qui se passe au niveau moléculaire dans une colonne [comment les molécules d’analytes interagissent avec la phase mobile et la phase stationnaire], nous pouvons mieux comprendre les différents processus liés à la diffusion qui se produisent et contribuent aux performances chromatographiques [Figure 22].

Plusieurs processus liés à la diffusion se produisent simultanément :

1. Les molécules d’analytes sont transportées jusqu’à la surface de la particule et autour de cette dernière [diffusion turbulente].
2. Les molécules d’analytes effectuent des allers-retours dans la phase mobile globale [diffusion longitudinale].
3. Les molécules d’analytes se diffusent à l’intérieur et à l’extérieur des pores chromatographiques [transfert de masse].

Ces procédés liés à la diffusion peuvent être exprimés mathématiquement sous la forme de l’équation de van Deemter.

L’équation de van Deemter est composée de trois termes :

• Le terme A [diffusion turbulente] est principalement lié à la granulométrie du matériau de remplissageconditionnement. Sa valeur est également déterminée par la qualité de remplissage du lit chromatographique. Elle est également liée à l’uniformité ou à la non-uniformité du débit vers et autour d’une particule.
• Le terme B [diffusion longitudinale] est lié à la diffusion de l’analyte dans la phase mobile globale et dans la phase stationnaire et diminue avec l’augmentation de la vitesse de la phase mobile [vélocité linéaire].
• Le terme C [transfert de masse] est lié à la fois à la vélocité linéaire [la vitesse de la phase mobile] et au carré de la granulométrie. Le transfert de masse est l’interaction des molécules d’analytes avec la surface interne de la phase stationnaire et leur distance de diffusion à l’intérieur et à l’extérieur des pores du matériau de remplissageconditionnement.

Nous pouvons observer ces termes individuellement en les reportant sur une échelle montrant la HETP par rapport à la vélocité linéaire [u] de la phase mobile [Figure 24].

Le terme A est représenté par une ligne horizontale. Il est lié à la granulométrie et à la qualité de remplissage d’une colonne et ne dépend pas de la vélocité linéaire [vitesse de la phase mobile]. À mesure que la granulométrie du matériau de remplissage diminue, la valeur H diminue également [efficacité plus élevée].

Le terme B est tracé sous forme d’une courbe à pente descendante lorsque la vélocité linéaire augmente. Ce terme est indépendant de la granulométrie et indique que si la phase mobile se déplace à une vélocité linéaire plus lente, les molécules d’analytes séjournent plus longtemps dans la colonne et, par conséquent, il existe une possibilité plus importante que les bandes s’étalent [diffusion] dans le sens de la longueur dans la colonne. Inversement, si la phase mobile se déplace à une vélocité linéaire plus rapide, la diffusion dure moins longtemps et il y a moins de temps pour qu’un étalement des bandes se produise.

Le terme C est représenté par une relation linéaire croissante entre H et u. Parmi plusieurs molécules, certaines entrent dans un pore de phase stationnaire tandis que d’autres restent dans la phase mobile en mouvement jusqu’à ce qu’elles atteignent une autre particule. Ceci est suivi par le processus inverse, où les molécules immobilisées se détachent et se déplacent plus loin dans le lit chromatographique. Une molécule met du temps à entrer et à sortir des pores. Par conséquent, à mesure que les molécules passent d’une particule à la suivante, la bande d’analytes contenant ces molécules s’élargit à mesure qu’elle se déplace le long de la colonne. Plus les particules de la phase stationnaire sont petites, plus ce processus est rapide, empêchant ainsi l’étalement des bandes d’analytes. Si la phase mobile se déplace rapidement, une plus grande distance se développe entre les molécules immobilisées et celles qui avancent. Ceci indique que pour que la population de molécules d’analytes reste groupée, la phase mobile doit se déplacer à une vélocité linéaire plus lente. À mesure que la vitesse de la phase mobile augmente, la population de molécules d’analytes se disperse, entraînant un étalement accru des bandes.

Une courbe de van Deemter se forme en additionnant les termes A, B et C [Figure 25]. Une séparation à la vélocité linéaire correspondant au point le plus bas de la courbe permet d’obtenir une efficacité et, par conséquent, une résolution chromatographique maximales.

Si nous établissons une corrélation avec l’équation de van Deemter présentée en figure 23, si la granulométrie est réduite de moitié, H est réduit d’un facteur 2. Par conséquent, il est possible de réduire l’étalement des bandes dans une colonne en utilisant une faible granulométrie.

Par exemple, la figure 26 montre un graphique de van Deemter d’une particule de 10 µm et d’une particule de 5 µm. Comme observé sur le tracé, une grande particule de 10 µm présente une plage de fonctionnement optimale très étroite par rapport à la vélocité linéaire, pour atteindre la valeur H la plus faible [18 µm à 0,7 mm/s]. Si la vitesse de la phase mobile est trop lente ou trop rapide, une augmentation de H [perte d’efficacité] est observée, réduisant ainsi la résolution et la sensibilité chromatographiques. Cependant, la particule de 5 µm présente une valeur H beaucoup plus faible [10 µm à 0,95 mm/s ; plus grande efficacité] à une vitesse de phase mobile plus élevée, ainsi qu’une plus grande plage de vélocité linéaire dans laquelle cette valeur H peut être atteinte. Cela signifie qu’une efficacité et, par conséquent, une résolution plus élevées peuvent être obtenues plus rapidement qu’avec une colonne remplie de particules plus grosses de 10 µm.

Pour mieux comprendre cet effet, nous pouvons étudier plus avant l’influence de la granulométrie sur chaque terme de l’équation de van Deemter.

La granulométrie a un impact significatif sur la bande d’analytes en ce qui concerne le terme A [diffusion turbulente]. Le chemin emprunté par les molécules d’analytes pour passer de la phase mobile globale à la surface de la particule et autour de cette dernière prend moins de temps à mesure que la granulométrie diminue. Les particules plus grosses amènent les molécules d’analytes à se déplacer sur des chemins plus longs et moins directs. Les différences dans ces chemins entraînent des temps de migration différents pour les molécules d’analytes au sein d’une population, provoquant l’élargissement de la bande d’analytes et du pic ainsi obtenu. À mesure que la granulométrie du remplissage diminue, les chemins des molécules d’analytes ont tendance à être de longueur quasi similaire. Il en résulte des bandes d’analytes plus étroites qui se traduisent par des pics plus étroits, une efficacité supérieure et une sensibilité plus élevée [Figure 27].

La diffusion longitudinale, le terme B, n’est pas directement affectée par la granulométrie. Cependant, à mesure que la granulométrie diminue, les autres paramètres de l’équation de van Deemter, les termes A et C, diminuent. Par conséquent, la vélocité linéaire optimale [vitesse de la phase mobile] augmente, ce qui réduit les possibilités d’étalement des bandes. Une vélocité linéaire plus lente permet à la bande de molécules d’analytes d’interagir avec le matériau de remplissage pendant une période plus longue. Cela signifie que la diffusion axiale [dans le sens de la longueur] dans la phase mobile dispose de plus de temps, ce qui entraîne des bandes d’analytes plus larges et plus diffuses. À une vélocité linéaire plus élevée, la population de molécules d’analytes est entraînée plus rapidement dans la colonne, ce qui permet à la bande d’analytes de rester plus concentrée et donne des pics plus étroits et plus efficaces du fait de la réduction du temps de diffusion longitudinale [Figure 28].

Le terme C [transfert de masse] est influencé à la fois par la vélocité linéaire et la granulométrie. Les populations de molécules d’analytes sont transportées de la phase mobile à la surface des particules. Les molécules d’analytes se déplacent ensuite à travers la phase mobile dans les pores jusqu’à la couche de surface liée (par exemple, C₁₈, C₈, etc.), puis interagissent avec la phase liée, puis sont entraînées hors des pores dans la phase mobile principale. Cependant, les molécules d’analytes au sein de la population entrent et sortent du pore à des degrés divers. Cela signifie que lorsque les molécules retournent dans la phase mobile globale, la longueur du chemin parcouru par chaque molécule d’analyte est différente, ce qui entraîne un étalement [élargissement] de la bande d’analytes [Figure 29]. L’étalement des bandes dépend de la vitesse de la phase mobile [Figure 30].

À une vélocité linéaire élevée, le temps entre le moment où les molécules interagissent avec la surface des particules et celui où elles traversent la phase mobile est plus long. Plus la vitesse de la phase mobile est rapide, plus les molécules d’analytes se déplacent rapidement dans la colonne, ce qui permet d’obtenir une bande d’analytes plus large et moins concentrée. Ceci se traduit par un pic chromatographique plus large et une sensibilité plus faible.

À une vélocité linéaire lente, la longueur des étapes entre les interactions jusqu’à la surface est plus courte. Il en résulte une bande d’analytes plus concentrée, produisant des pics chromatographiques plus étroits et plus efficaces.

Le transfert de masse s’améliore considérablement à mesure que la granulométrie diminue en raison de sa relation avec le carré de la granulométrie [d_p²]. Pour la faible granulométrie, la molécule d’analyte met moins de temps à pénétrer dans les pores, à interagir avec la surface chromatographique et à être ramenée dans la phase mobile. Par conséquent, les molécules d’analytes séparées sur des colonnes de faible granulométrie se diffusent beaucoup plus rapidement, ce qui permet d’obtenir une bande chromatographique plus fine, plus étroite et plus efficace [Figure 31].

La réduction de la granulométrie améliorera donc le transfert de masse, diminuant ainsi efficacement la pente du terme C, ce qui nous amène là où nous en sommes aujourd’hui avec la technologie UPLC. Comme le montre le graphique de van Deemter de la figure 32, les particules de 1,7 µm fournissent des valeurs de HETP 2 à 3x inférieures de 2 à 3x à celles des particules de 3,5 µm. De plus, ces valeurs H plus faibles sont obtenues à une vélocité linéaire plus élevée et sur une plage de vélocités plus large. Cela signifie que le transfert de masse est considérablement amélioré avec la faible granulométrie, ce qui permet une efficacité et une résolution accrues. Cela signifie également qu’il est possible d’utiliser une plage plus étendue de vélocités linéaires pour obtenir ces performances améliorées. Les séparations peuvent être effectuées à des vélocités linéaires supérieures, améliorant ainsi la vitesse d’analyse, sans compromettre la résolution.

Impact de l’étalement des bandes [de l’instrument] extra-colonne sur les graphiques de van Deemter

La technologie UPLC montant en puissance et devenant de plus en plus populaire dans les laboratoires chromatographiques, les graphiques de van Deemter sont devenus une méthode répandue pour mesurer les gains de performance des particules inférieures à 2 µm par rapport aux granulométries HPLC existantes. Des conclusions erronées peuvent être tirées si ces mesures comparatives ne sont pas effectuées sur un instrument qui réduit au minimum la contribution de l’étalement des bandes extra-colonne.

Pour démontrer l’importance de l’étalement des bandes extra-colonnes sur la mesure des performances, des graphiques de van Deemter ont été créés sur un instrument de HPLC classique [étalement des bandes = 7,2 µL], en comparant des particules de 1,7 µm avec celles de 2,5 µm [Figure 33]. Le substrat des particules et la chimie de la phase liée des deux colonnes étaient identiques. À première vue, les graphiques de van Deemter déduisent qu’il n’y a pas de différence notable dans les performances de ces deux colonnes. Comment est-ce possible ?

Dans ce cas, l’étalement des bandes de l’instrument de HPLC entraîne une mesure des performances de la colonne de UPLC à particules de 1,7 µm similaire à celle de la colonne de HPLC de 2,5 µm. Les largeurs de pic plus petites produites par les colonnes d’UPLC à particules de 1,7 µm sont plus affectées par l’élargissement des bandes extra-colonne que les colonnes remplies de particules plus grandes [par exemple, 2,5 µm], ce qui entraîne ce résultat trompeur.

La même expérience a ensuite été menée sur un instrument ACQUITY UPLC [étalement des bandes = 2,8 µL]. L’instrument ACQUITY UPLC présente un volume du système environ 84 % moindre et un étalement des bandes 60 % moindre par rapport à l’instrument de HPLC.

Comme le montre la figure 34, une différence notable des performances est observée pour ces deux colonnes lorsqu’elles sont utilisées sur l’instrument ACQUITY UPLC. En plus des différences observées pour la HEPT, la vélocité linéaire optimale augmente de 3,0 mm/s [particule de 2,5 µm] à 10,0 mm/s [particule de 1,7 µm], ce qui démontre les gains de performance d’une HETP plus faible [efficacité supérieure] et d’une vélocité linéaire plus importante [et donc un débit plus rapide] associés à la technologie UPLC.

Maintien de l’intégrité de la séparation sans compromis

Maintenant que nous avons acquis une compréhension de base des fonctions d’étalement des bandes extra-colonne et intra-colonne, nous pouvons associer la mesure de ces termes [HETP par rapport à la vélocité linéaire] d’une manière plus pratique : nombre de plateaux par rapport au débit.

Comme indiqué précédemment, la vélocité linéaire est la vitesse de la phase mobile lorsqu’elle s’écoule dans la colonne. Il s’agit d’un terme utilisé pour normaliser le débit de la phase mobile indépendamment du diamètre interne de la colonne, de sorte que les performances de colonnes de dimensions différentes puissent être mesurées et comparées. La vélocité linéaire optimale est directement liée au débit optimal [Figure 35]. Les colonnes de HPLC classiques ne peuvent être utilisées que dans une plage de débit étroite pour obtenir des performances optimales. Si l’on travaille en dehors de cette plage, on peut s’attendre à une diminution des performances.

Une approche courante pour réduire le temps d’analyse [améliorer le débit] en HPLC classique consiste à simplement augmenter le débit. Avec des particules plus grosses, l’augmentation du débit entraîne souvent une perte importante d’efficacité, et donc de résolution, étant donné que vous travaillez désormais au-dessus de la vélocité linéaire optimale pour la particule HPLC [chromatographie compressée]. Il s’agit d’un compromis significatif entre les performances chromatographiques et la vitesse d’analyse associée à la HPLC [Figure 36].

La technologie UPLC n’est pas sujette àsusceptible de ces compromis. La durée d’analyse peut être réduite sans sacrifier les performances. Lorsque la granulométrie diminue de 3,5 µm à 1,7 µm, une augmentation significative de l’efficacité est observée [Figure 37]. Ceci est dû aux bandes chromatographiques étroites produites par les colonnes d’UPLC à particules de 1,7 µm du fait d’un étalement négligeable des bandes intra-colonne. De plusEn outre, cette efficacité accrue se produit à un débit plus élevé [Figure 37]. Cela signifie que pour une longueur de colonne identique, une augmentation significative de l’efficacité, et donc de la résolution, peut être obtenue en un temps d’analyse plus court.

Compréhension de la puissance de résolution de la colonne [L/dp]

Lors d’une séparation chromatographique, l’objectif principal est de séparer un composant d’un autre afin de pouvoir mesurer tout ou partie des composants. La puissance de résolution maximale d’une colonne peut être estimée en divisant la longueur de la colonne [L] par la granulométrie [d_p]. Le rapport L/d_p est particulièrement utile pour déterminer la granulométrie du matériau de remplissage et la longueur de la colonne nécessaires pour une application donnée [Figure 38].

Ce rapport peut également servir d’outil pour transférer des méthodes d’une granulométrie à une autre. Une colonne qui présente un rapport L/d_p de 30 000 [séparation modérément difficile] est un choix très courant. Comme le montre la figure 39, une colonne de HPLC typique qui produit une puissance de résolution de 30 000 mesure 150 mm de long et est remplie de particules de 5 µm. À mesure que la granulométrie diminue, la même puissance de résolution peut être obtenue dans une colonne plus courte [ce qui signifie un temps d’analyse plus court ; c’est-à-dire qu’une colonne de 50 mm de long remplie de particules de 1,7 µm permet d’obtenir un rapport L/d_p de 30 000]. En plus de la longueur de colonne plus courte, le débit optimal augmente à mesure que la granulométrie diminue, ce qui ajoute encore à la réduction de la durée d’analyse.

Ceci est plus clairement démontré par chromatographie [Figure 40]. Une colonne d’UPLC de 50 mm de long remplie de particules de 1,7 µm produit la même puissance de résolution qu’une colonne de HPLC de 150 mm de long remplie de particules de 5 µm. En maintenant le rapport L/d_p constant, la durée d’analyse est raccourcie de 10x tout en conservant la résolution. Les débits ont été ajustés de façon inversement proportionnelle à la granulométrie. Les volumes d’injection ont été mis à l’échelle proportionnellement au volume de la colonne de sorte que la même charge massique sur la colonne soit injectée.

La compréhension du rôle du rapport de la longueur de colonne à la granulométrie [L/d_p] est essentielle à la compréhension de la technologie UPLC. La technologie UPLC repose sur le remplissage efficace avec des petites particules tolérantes à la pression dans des colonnes courtes [haut débit] ou longues [haute résolution]. Ces colonnes d’UPLC sont utilisées dans un instrument LC conçu pour fonctionner à la vélocité linéaire [et à la pression ainsi obtenue] optimale de ces particules avec un étalement de bandes minimal.

Mesure des performances de séparation du gradient [capacité de pic]

Dans des conditions isocratiques, le nombre de plateaux [N] est une mesure des contributions cumulatives de l’étalement des bandes de l’instrument et de la colonne. En raison de l’élargissement des bandes lié à la diffusion, la largeur de la bande d’analytes est d'autant plus grande que la bande est retenue longtemps sur la phase stationnaire.

Dans une analyse en gradient, la force d’élution de la phase mobile change au cours de l’analyse. Les bandes d’analytes retenues plus fortement se déplacent ainsi plus rapidement dans la colonne [modifiant ainsi le temps de rétention], ce qui garde les bandes plus concentrées [étroites]. En chromatographie en phase inverse, la force d’élution croissante de la phase mobile détermine la largeur des bandes produites, ce qui permet d’obtenir des largeurs de pic similaires à mesure que les bandes passent à travers le détecteur. La largeur de pic et le temps de rétention étant modifiés par les variations de force de la phase mobile, le nombre de plateaux [en raison de sa relation avec la largeur de pic] ne constitue pas une mesure valide pour les séparations par gradient.

La puissance de résolution [séparation] d’un gradient peut être calculée par sa capacité de pic [P_c]. Ainsi, la capacité de pic est simplement le nombre théorique de pics qui peuvent être séparés en une durée du gradient donnée. La capacité de pic est inversement proportionnelle à la largeur de pic. Par conséquent, pour que P_c augmente, la largeur de pic doit diminuer.

La capacité de pic peut être considérablement augmentée grâce à la technologie UPLC. La puissance de résolution élevée de la technologie UPLC permet de générer davantage d’informations par unité de temps en exploitant la puissance des particules inférieures à 2 µm sur des instruments à dispersion exceptionnellement faible [étalement des bandes de 2,8 µL]. Cela facilite la collecte d’informations supplémentaires à partir d’un échantillon donné. Par exemple, une digestion trypsique de la phosphorylase b produit ~70 pics identifiés sur une colonne de HPLC remplie de particules de 5 µm [Figure 43A]. Avec la technologie UPLC, le nombre de pics identifiables passe de 70 à 168, améliorant ainsi la fiabilité de l’identification des protéines [Figure 43B].