Leitfaden zur Massenspektrometrie

Lösungsmittel und Hinweise zur LC-MS

Lösungsmittel werden in der Regel auf Basis der Löslichkeit einer interessierenden Verbindung und der Kompatibilität mit verschiedenen Ionisierungstechniken, die bei der LC-MS verwendet werden, ausgewählt. Die Flüchtigkeit und die Fähigkeit des Lösungsmittels, ein Proton abzugeben, sind bei der ESI und anderen atmosphärischen Ionisierungstechniken wichtig.

Verwendet werden protische Primärlösungsmittel wie Methanol und Mischungen mit Wasser, z. B. 1:1 Methanol/Wasser oder 1:1 Acetonitril/H₂O (obwohl die Wasser/Methanol-Mischung die Viskosität aufgrund einer daraus resultierenden exothermen Reaktion weit über die von Wasser oder Menthol als reines Lösungsmittel hinaus erhöht). Der relativ niedrige Dampfdruck von Wasser kann die Empfindlichkeit beeinträchtigen, wenn es bei 100 % verwendet wird. Eine bessere Empfindlichkeit ergibt sich, wenn die Oberflächenspannung durch Zugabe eines flüchtigen organischen Lösungsmittels verringert wird. Tenside mit höherer Protonenaffinität erhöhen zwar die Ionenfreisetzung aus vernebelten Tröpfchen, können aber auch die Empfindlichkeit verringern.

Aprotische Co-Lösungsmittel wie 10 % DMSO in Wasser und Isopropylalkohol verbessern die Löslichkeit einiger Verbindungen. Ameisensäure wird oft in geringen Mengen (0,1 %) zugesetzt, um die Ionisierung zu erleichtern, indem sichergestellt wird, dass der Analyt basischer ist als das Lösungsmittel. Selbst in geringen Mengen können einige Säuren wie z. B. TFA, die für ansonsten unlösliche Verbindungen notwendig sind, die Empfindlichkeit einschränken.

Im ESI-Ionisierungsmodus führen Puffer und Salze (Na⁺, K⁺ und Phosphat) zu einer Verringerung des Dampfdrucks und folglich zu einem reduzierten Signal. Die erhöhte Oberflächenspannung der Tröpfchen und die daraus resultierende geringere Flüchtigkeit kann durch die Verwendung von relativ flüchtigeren Puffern wie Ammoniumacetat, das durch ein schwaches Säure-Base-Paar gebildet wird, behoben werden.

Anmerkungen zu Lösungsmitteln

Das Lösungsmittel in der Gasphase beschränkt die ESI-Ionisierung auf Moleküle, die basischer sind als das Lösungsmittel. Die Ausnahme ist die Photoionisation (die keine Säure/Base-Ionisation ist), die aber dennoch durch das Lösungsmittel vermittelt wird.
Wenn Lösungsmittel und Wasserdampf aus dem Ionisationsbereich entfernt werden, erhöht sich die Anzahl der Verbindungen, die bei atmosphärischem Druck ionisiert werden können.
Eine Verringerung des Flüssigkeitsvolumens im Verhältnis zu der in der Flüssigkeit enthaltenen Probe oder dem nachzuweisenden Analyten verbessert die ESI-Leistung (d. h. niedrigere Flussraten).
Nützliche Lösungsmittel
- Wasser
- Acetonitril
- Methanol
- Ethanol
- Propanol
- Isopropanol
Zulässige Zusatzstoffe
- Essigsäure
- Ameisensäure
- Ammoniumhydroxid
- Ammoniumformiat (Salzkonzentration = 10 mM oder weniger)
- Ammoniumacetat (Salzkonzentration = 10 mM oder weniger)
Nichtflüchtige Salze (Phosphat, Borat, Citrat usw.)
- Können sich in der Quelle ablagern und die Kapillaren verstopfen, sodass mehr Reinigungs- und Wartungsarbeiten erforderlich sind
- Moderne Quellendesigns können nichtflüchtige Stoffe besser handhaben als ältere Designs
Oberflächenaktive Substanzen (Tenside/Detergenzien) unterdrücken die Elektrospray-Ionisierung
Anorganische Säuren sind ätzend
Trifluoressigsäure (TFA)
- Unterdrückt bis zu einem gewissen Grad positiven Ionen-Elektrospray bei Konzentrationen über 0,01 %.
- Stark unterdrückter negativer Ionen-Elektrospray.
Triethylamin (TEA)
- Hoher PA (232 kcal/mol) ergibt ein intensives [M+H]+ Ion bei m/z 102
- Unterdrückt positiven Ionen-Elektrospray von weniger basischen Verbindungen.
Tetrahydrofuran (THF)
- 100 % THF ist leicht entzündlich, daher verwenden APCI- und die meisten Schnittstellentechniken Stickstoff als Zerstäubergas. (Bei Verwendung von Luft besteht Explosionsgefahr).
- Reagiert mit PEEK-Kapillaren.

Ionenunterdrückung und chemische Wahl

Ionenunterdrückung ist eines der sichtbareren Probleme, mit denen Spektrometer konfrontiert sind, die ESI als Ionisierungstechnik verwenden. Die Veröffentlichung Guidance for Industry on Bioanalytical Method Validation der U.S. Food and Drug Administration (FDA) (Federal. Register, 66, 100, 28526) aus dem Jahr 2001 zeigt, dass solche Überlegungen notwendig sind, um sicherzustellen, dass die Qualität der Analyse nicht beeinträchtigt wird. In dem Artikel werden mehrere experimentelle Protokolle zur Bewertung des Vorhandenseins von Ionenunterdrückung notiert. Man vergleicht das Multiple-Reaction-Monitoring (MRM)-Signal (Peakflächen oder Peakhöhen) eines Analyten in einer dotierten Probe nach der Extraktion mit dem Analyt, das direkt in die reine mobile Phase injiziert wird. Ein im Vergleich zum reinen Lösungsmittel schwaches Analytsignal in der Matrix weist auf das Vorhandensein von Interferenzen hin.

Eine Publikation von C. Mallet et al. beschreibt, wobei die Matrixeffekte des Chromatogramms auf den Analyten (und den internen Standard) vorhanden sind. Die Experimentatoren verwenden einen kontinuierlichen Fluss einer Standardlösung, die den nachzuweisenden Analyten und seinen internen Standard enthält, der dem Säulenablauf zugesetzt wird. Nach Injektion eines Blindprobenextrakts in das LC-System weist ein Abfall der konstanten Basislinie auf eine Unterdrückung der Ionisierung des Analyten aufgrund des Vorhandenseins von störendem Material hin.

Säulenmaterialien

Eine grundlegende Änderung der Technologie ist das Aufkommen hybrider Säulenmaterialien und hochselektiver Partikel mit einem Durchmesser von weniger als zwei Mikrometern. Die Hybridchemie ist weniger auf Modifikatoren für mobile Phasen angewiesen, die eine Ionenunterdrückung verursachen können, und erhöht die Selektivität von Partikeln.

Ultrahochdruck-LC im Vergleich zu herkömmlicher HPLC

Die kürzliche Kommerzialisierung der Arbeit von Prof. J. Jorgenson (University of North Carolina), die oft allgemein als UHPLC (Ultra High Pressure Liquid Chromatography) bezeichnet wird, bietet ein Potential zur Verbesserung der aus typischen LC/MS-Analysen gewonnenen Informationen. Von Waters Corporation als UPLC oder Ultra Performance Liquid Chromatography (Ultraschallchromatographie) vermarktet, ermöglicht die im Vergleich zur HPLC erhöhte Peakkapazität die Definition chemischer Einheiten, die ansonsten unter den breiteren Peaks der HPLC koeluiert hätten. Die Konzentration von Peaks in Banden von (in der Regel) zwei Sekunden oder weniger Breite erhöht das Potential für eine höhere Empfindlichkeit, da das Massenspektrometer besser auf Verbesserungen des Signal-Rausch-Verhältnisses reagiert.

Das UPLC-Konzept verändert vertraute Parameter, die in der traditionellen Trennpraxis etabliert sind, wie Flussraten, Partikelgrößen – sogar unsere Einschätzung von van Deemter-Kurven. Wenn der Betriebsdruck von ~2000 psi auf bis zu 20000 psi ansteigt, nähern sich Partikeldurchmesser von weniger als 2 µm der theoretischen Grenze, die 1969 von John Knox in seiner „Knox-Gleichung“ beschrieben wurde. Sobald die damit verbundenen Probleme der erhöhten mechanischen Beanspruchung und der übertriebenen thermischen Effekte angegangen wurden, sind Verbesserungen der MS-Leistung eine etwas widersprüchliche Konsequenz aus der Theorie.

Betrachtet man die Veränderungen der Effizienz aufgrund der linearen Geschwindigkeit, dargestellt als van-Deemter-Diagramm, so zeigen Säulen, die mit Partikeln mit einem Durchmesser von 1,7 μm gefüllt sind, unabhängig von der Flussrate eine bessere Leistung.

Obwohl alle Säulen eine verringerte Leistung bei extrem niedrigen linearen Geschwindigkeiten aufweisen, eine Tatsache, an die wir bei der HPLC-Praxis gewöhnt sind, arbeiten Säulen mit kleinerem Durchmesser besser und zeigen weniger Leistungseinbußen bei erhöhter linearer Geschwindigkeit.

Ein Beispiel dafür, wie die Technologie den Ansatz des Versuchsdesigns neu definiert hat, ist der Vergleich von so genannten „alten“ HPLC-Trennungen mit UPLC-Trennungen. Nicht nur die zugrundeliegenden Prinzipien definieren Trennungen neu (bis zu viermal kürzer), sondern auch die Selektivität, um verborgene Details wie die Metaboliten von Midazolam in der Abbildung aufzudecken. Die verbesserte Trennung weist auf ein zweites Glukuronidmetabolit hin, m/z = 548,125.

Technologische Fortschritte decken oft mehr Details auf, wie z. B. die erhöhte Peakkapazität der UPLC im Vergleich zur herkömmlichen HPLC-Trennung eines vermeintlich einzelnen Glucuronids zeigt

Siehe www.waters.com Resource Library Leitfäden zu HPLC und UPLC

Siehe auch:

C.R. Mallet, Z. Lu, und J.R. Mazzeo, A study of ion suppression effects in electrospray ionization from mobile phase additives and solid-phase extracts, Rapid Commun. Mass Spectrom. Vol 18, 1, S. 49 – 58 2004.
- Warum dies wichtig ist: Häufig zitierte Arbeiten über SPE-Vergleiche.
L.L. Jessome, D. A. Volmer, Ion Suppression: A Major Concern in Mass Spectrometry, LCGC, Vol 24, 5. Mai 2006
- Warum diese wichtig sind: Bietet eine umfassende Diskussion eines der Haupthindernisse bei der ESI – Änderungen der Protonenaffinität in der Gasphase, die die Quantifizierung beeinflussen.
Toyo'oka, Toshimasa, Determination Methods for Biologically Active Compounds by Ultra-Performance Liquid Chromatography Coupled with Mass Spectrometry: Application to the Analyses of Pharmaceuticals, Foods, Plants, Environments, Metabonomics, and Metabolomics, Journal of Chromatographic Science, Vol 46, 3. März 2008, S. 233-247
- Warum dies wichtig ist: Bietet einen umfassenden Überblick über Veröffentlichungen zur modernen Chromatographiepraxis.
U. Neue, Theory of peak capacity in gradient elution, J Chromatogr A. 2005 Jun 24;1079 (1-2): 153-61.
- Warum dies wichtig ist: Aktuelle Diskussion der modernen Chromatographiepraxis.
J. H. Knox und M. Saleem, Kinetic Conditions for Optimum Speed and Resolution in Column Chromatography, J. Chromatogr. Sci., 7 (1969) 614-622
- Warum dies wichtig ist: Eines der Grundlagenpapiere zur Vorhersage der modernen Chromatographiepraxis.