Charakterisierung von Spektren, die durch Desorption und weiche Ionisierung erzeugt wurden
Die Retro-Diehls-Alder-Reaktionen und hämolytischen/heterolytischen Energien, die für die Dissoziation oder Spaltung von Bindungen, die zu einer spezifischen, gut charakterisierten Fragmentierung führen, erforderlich sind, bilden weiterhin die Grundlage für unser Denken gegenüber Massenspektren. Das Schwierige an der MS liegt oft in der Beantwortung der von Fred W. McLafferty gestellten Frage, die maßgeblich zu unserem Verständnis der Interpretationsregeln beigetragen hat: „Was ist die Masse, mit der wir es zu tun haben?“
Bis zur Entwicklung von Desorptionstechniken wie der matrixunterstützten Laser-Desorption-Ionisierung (MALDI) und dem Elektrospray schien diese Frage zeitweise einfacher zu beantworten. Wie einfach, hing davon ab, ob die Probe derivatisiert werden musste, um sie flüchtig und für GC-MS zugänglich zu machen. Hier waren die Spektren oft von den derivatisierten Gruppen dominiert und zeigten wenige oder kein Molekülion (daher die Notwendigkeit für CI). In diesem Fall hat das Aufkommen von Elektrospray und APCI sicherlich zur Identifizierung des Molekulargewichts einfach geladener Verbindungen mit kleinen Molekülen beigetragen. Zumindest hat sich die MS in diesen Fällen mit dem m/z-Wert von Ionen beschäftigt, die nur eine einzige Ladung zeigten. Die Masse eines Analyten wurde in der Regel als nominale Masse (nominaler m/z-Wert) des Molekülions angegeben, die der nominalen Masse des Moleküls entspricht. Die nominale Masse eines Ions, Moleküls oder Radikals ist die Summe der nominalen Massen der Elemente in seiner elementaren Zusammensetzung. Die nominale Masse eines Elements ist die ganzzahlige Masse des häufigsten, natürlich vorkommenden, stabilen Isotops.
Die Antwort wurde jedoch immer schwieriger, als Soft-Ionisations-Desorptionstechniken wie die Elektrospray-Ionisation (ESI) Anfang der 1990er-Jahre kommerzielle Verbreitung fanden. Im Zeitalter der MS vor der Desorption betrug die nominale Masse der meisten MS-abgefragten Analyten weniger als 500 Da. Massendefekte aufgrund des Vorhandenseins von Wasserstoff waren bei diesen Analyten kein Problem. Die obere m/z-Grenze lag bei den meisten Massenspektrometern im Bereich von 650 – 800. Daher hatten in diesen Tagen vor der Desorption die nominale Masse und die ganzzahlige Monoisotopenmasse den gleichen Wert. Die Monoisotopenmasse eines Ions, Moleküls oder Radikals ist die Summe der Monoisotopenmassen der Elemente in seiner elementaren Zusammensetzung. Die Monoisotopenmasse eines Elements ist die exakte Masse des häufigsten, natürlich vorkommenden, stabilen Isotops.
Zu Beginn der Ära der Desorption und Ionisierung wurden größere Moleküle und größere Präzision ein wichtiger Bestandteil der Studien, da die Technologie dies ohne Weiteres zuließ. Erst dann wurde die Frage der Massenfehler so wichtig. In einem Massenspektrometer, das nur bis zum nächsten ganzzahligen m/z-Wert berichten kann, könnte das Molekülion einer C50H102-Verbindung durch einen Peak bei m/z 703 statt bei m/z 702 dargestellt werden, da das Molekülion eine monoisotope Masse von 702,7825 hätte, wodurch auf die ganze Zahl 703 gerundet wird.
Oberhalb von 500 Da können Massendefekte bei der Bestimmung der m/z-Werte von MS-Peaks ein ernsthaftes Problem darstellen. Beachten Sie, dass das Massenspektrometer Signalintensitäten misst, die zu einem bestimmten Zeitpunkt während der Aufnahme des Massenspektrums auftreten, unabhängig vom verwendeten m/z-Analysatortyp. Der berichtete m/z-Wert ist eine Funktion der Zeit, die Ionen eines bekannten m/z-Werts, die von einer spezifischen Verbindung – im Verhältnis zur Kalibrierverbindung – produziert werden, den Detektor erreichen.
Da sich die Masse monoisotoper Ionen mit der Position auf der m/z-Skala ändert, kann das Massenspektrometer, das ganzzahlige m/z-Werte meldet, tatsächlich alle 0,05 m/z-Einheiten messen. Die erfasste Intensität kann die am Scheitelpunkt des massenspektralen Peaks oder die Summe der Intensitäten über den massenspektralen Peak sein. Der angegebene m/z-Wert ist eine ganze Zahl, die durch Runden des beobachteten m/z-Werts für das massenspektrale Peakmaximum erhalten wird.
Zur Kalibrierung der m/z-Skala verwendet die Elektronenionisations-MS häufig perfluorierte Verbindungen wie Perfluortributylamin (nominelles Molekulargewicht von 671). Das liegt daran, dass die ganzzahlige Masse eines Ions fast gleich seiner Monoisotopenmasse ist. Sobald ein Ion eine nominale Masse von 1000 Da überschreitet, wird kein Peak im nominalen m/z-Wert mehr im Massenspektrum beobachtet. Der monoisotope Massenpeak ist um einen Betrag versetzt, der dem Massendefekt des Ions entspricht. Bei Einzelladungsionen mit Massen über 500 Da werden die Isotopenpeaks mithilfe von Techniken wie Elektrospray mit Transmissionsquadrupol- oder Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometern, die eine Einheitsauflösung über die m/z-Skala aufweisen, klar getrennt.
Von den vielen Diskussionen über die Rolle von Isotopen bei der Bestimmung der Identität einer Verbindung wurde eine in der LCGC Europe veröffentlicht, die zu einem hilfreichen Gleichgewicht beiträgt. „Interpretation of Isotope Peaks in Small Molecule LC–MS“ (L.M. Hill, LCGC Europe 19(4), S. 226 – 238 (2006) basiert auf Ionenfallen mit niedriger Auflösung. An einer wichtigen Stelle warnt der Autor vor übermäßigem Vertrauen bei der Verwendung von Ionenfallen: „Anwender von [I]onenfallen müssen vorsichtiger sein als Anwender von QtoF- oder Triple-Quadrupol-Systemen. Es ist selbstverständlich notwendig, mit dem kontaminationsfreien +1-Isotopenpeak zu beginnen... Ionenfallen neigen zum Einfangen mit einer geringeren Auflösung als sie scannen... Leeren der Falle... in der Reihenfolge der Masse.“ Dies bedeutet nicht, dass Ionenfallen nicht verwendet werden können, sondern, wie alle Geräte, mit einem Verständnis ihrer Fähigkeiten und ihrer Grenzen.
Ebenso überträgt ein Gerät mit sehr hoher Auflösung nicht automatisch die richtige Antwort. Ein Datensatz, der in einem Artikel von Kind und Fiehn vorgestellt wurde – T. Kind und O. Fiehn, BMC Bioinformatics 7, 234 (2006) – ist besonders auffällig und führte zu ihrem Schluss, den sie auf Basis der Untersuchung von 1,6 Millionen Formelsuchergebnissen erarbeiteten: „Eine hohe Massengenauigkeit (1 ppm) und ein hohes Auflösungsvermögen allein [sind] nicht ausreichend... nur ein Isotopenhäufigkeitsmusterfilter [ist] in der Lage, die Anzahl der Molekülformelkandidaten zu reduzieren.“ Massenspektrometer mit einer Massengenauigkeit von nur 3 ppm, aber einer Genauigkeit von 2 % Isotopenmuster entfernen in der Regel mehr als 95 % der falschen Kandidaten. Diese Leistung würde sogar Massenspektrometer übertreffen, die für 0,1 ppm geeignet sind – wenn es solche Geräte tatsächlich gäbe –, die nicht mit Isotopenmustern ausgestattet sind.
Zwischen Massen von 150 Da und 900 Da erhöhte sich die Anzahl der möglichen Formeln, die als Massengenauigkeit aufgeführt sind, ohne Zuhilfenahme von Isotopenhäufigkeitsinformationen von 10 ppm auf 0,1 ppm: von einem Tief von 2 Kandidatenformeln bei 150 Da auf 3447 bei 900 Da für 10 ppm. Selbst am oberen Ende (900 Da) ergibt allein eine Massengenauigkeit von 1 ppm 345 Kandidaten. Unter Verwendung einer Genauigkeit von 2 % der Isotopenhäufigkeit wird die Anzahl der Kandidaten bei 900 Da auf sinnvolle 18 reduziert. Sie zeigen auch, dass eine geringe Genauigkeit von 5 % für die Isotopenaufnahme in Verbindung mit einer Genauigkeit von 5 ppm 196 Kandidaten ergibt.
