Leitfaden zu UPLC

Wenn wir an chromatographische Auflösung im einfachsten Sinne denken, dann ist sie einfach die Breite [w] zweier Peaks in Bezug auf den Abstand [t_R,2–t_R,1] zwischen diesen Peaks. Wenn wir diese Peaks schmaler oder weiter auseinander setzen können, können wir die Auflösung verbessern.

Die Auflösung kann mathematisch relevanter in Form der grundlegenden Auflösungsgleichung ausgedrückt werden. Die Auflösungsgleichung besteht aus physikalischen und chemischen Parametern, die die chromatographische Auflösung beeinflussen; Effizienz [N], Selektivität [α] und Kapazität [k]. Selektivität und Kapazität sind chemische Faktoren, die zur Verbesserung der Auflösung traditionell leichter zu manipulieren sind. Diese Parameter können durch Änderungen wie Temperatur, Elutionslösungsmittel, Zusammensetzung der mobilen Phase und Säulenchemie beeinflusst werden. Die Effizienz ist ein physikalischer [mechanischer] Parameter, der aufgrund des Einflusses der Quadratwurzel auf die Auflösung schwieriger zu manipulieren ist. Die Effizienz kann sich jedoch erheblich auf die Auflösung auswirken, wenn die Partikelgröße sehr klein ist. Der Schwerpunkt der UPLC-Technologie liegt auf der Verbesserung der Auflösung durch den Einsatz von Sub-2-µm-Partikeln zur Verbesserung der Systemeffizienz.

Es ist einfacher zu verstehen, wie diese Parameter die Auflösung beeinflussen, wenn wir darüber nachdenken, wie diese drei Terme chromatographisch dargestellt werden [Abbildung 15]. Kapazität [k] und Selektivität [α] sind chemische Faktoren, die Peaks relativ zueinander verschieben und ein Maß für die Wechselwirkung der Analyten mit der stationären und der mobilen Phase sind. Wir können die Auflösung verbessern, indem wir k erhöhen. Daraus resultieren jedoch längere Retentionszeiten, geringere Empfindlichkeit und größere Peakbreiten. Eine Erhöhung von α kann zu einer höheren Auflösung, derselben Elutionsreihenfolge des Peaks in einer ähnlichen Zeit und/oder einer Änderung der Elutionsreihenfolge führen. Die Effizienz [N] ist ein physikalisches Maß für die Bandenverbreiterung in einer Trennung. Unter der Annahme, dass N durch Verringern der Partikelgröße des Packungsmaterials verbessert wird, ändert sich der Peak-Mittenabstand nicht. Außerdem führt eine Verringerung der Partikelgröße zu schmaleren und effizienteren chromatographischen Peaks, wodurch Auflösung und Empfindlichkeit verbessert werden.

Die Beziehung zwischen Auflösung, Effizienz und Partikelgröße

Die UPLC-Technologie maximiert den physikalischen [mechanischen] Beitrag zur Auflösung durch Minimierung der Gerätebandenverbreiterung, wodurch die Verwendung von Säulen mit höherer Effizienz und kleineren Partikeln ermöglicht wird [1,7 µm–1,8 µm]. Mit einfachen chromatographischen Beispielen und grundlegender Arithmetik sind die chromatographischen Prinzipien der UPLC-Technologie besser zu verstehen.

Wie in der grundlegenden Auflösungsgleichung angegeben, ist die Auflösung direkt proportional zur Quadratwurzel der Effizienz.

Außerdem ist die Effizienz umgekehrt proportional zur Partikelgröße. Das heißt, wenn die Partikelgröße des Packungsmaterials verringert wird, steigt die Trenneffizienz. Wenn zum Beispiel die Partikelgröße des Packungsmaterials von 5 µm auf 1,7 µm [3´] reduziert wird, sagt die Theorie voraus, dass sich die Effizienz um 3´ erhöht, was zu einer 1,7´ höheren Auflösung [Quadratwurzel von 3] führt.

Um die theoretisch vorhergesagten Effizienz- und Auflösungsgewinne zu erreichen, muss die optimale Flussrate in Bezug auf die Partikelgröße verwendet werden. Die optimale Flussrate [F_opt] ist umgekehrt proportional zur Partikelgröße. Das heißt, wenn die Partikelgröße von 5 µm auf 1,7 µm [3´] reduziert wird, erhöht sich die optimale Flussrate, mit der dieses Partikel verwendet werden kann, um 3´, was zu einer Verkürzung der Analysezeit im gleichen Maße [3´] führt. Dadurch wird der Probendurchsatz erhöht.

Eines der ersten Dinge, die wir als Chromatographieanwender beobachten, ist, was passiert, wenn die chromatographische Flussrate geändert wird. Wenn die Flussrate erhöht wird, verkürzt sich die analytische Laufzeit. Außerdem nimmt die Breite des Peaks ab. Mit abnehmender Peakbreite nimmt die Höhe dieses Peaks proportional zu. Schmalere Peaks, die höher sind, sind leichter zu erkennen und vom Basislinienrauschen zu unterscheiden [höheres S/N], was zu einer höheren Empfindlichkeit führt.

Diese theoretischen Grundlagen wurden chromatographisch angewendet. Wie in Abbildung 20 zu sehen ist, kann die theoretische Leistung einer Säule erreicht werden, wenn die Bandenverbreiterung außerhalb der Säule wie beim ACQUITY UPLC System minimiert wird.

Die obige Diskussion zeigt die Bedeutung der Bandenverbreiterung innerhalb der Säule. Wenn man besser versteht, welche Prozesse die Bandenverbreiterung beeinflussen und wie sie reduziert werden kann, können Verbesserungen der Effizienz und damit der Auflösung erreicht werden.

Van-Deemter-Kurven verstehen

Wie bereits beschrieben, kann man sich die Breite eines Peaks als statistische Verteilung der Analytmoleküle vorstellen [Varianz, σ²]. Die Peakbreite nimmt proportional zur zurückgelegten Wegstrecke des Peaks linear zu. Die Beziehung zwischen der Peakbreite und der zurückgelegten Wegstrecke des Peaks wird als Höhe eines theoretischen Bodens [HETP oder H] bezeichnet. H stammt aus der Destillationstheorie und ist ein Maß für die Säulenleistung, das mehrere Prozesse im Zusammenhang mit der Bandenverbreiterung berücksichtigt. In einfacheren Termen ausgedrückt: Je kleiner HETP, desto mehr Böden [N] befinden sich in einer Säule [Abbildung 21].

Wenn wir darüber nachdenken, was auf molekularer Ebene innerhalb einer Säule passiert [wie die Analytmoleküle mit der mobilen Phase und der stationären Phase interagieren], können wir die verschiedenen mit der Diffusion verbundenen Prozesse besser verstehen, die zur chromatographischen Leistung beitragen [Abbildung 22].

Es gibt mehrere diffusionsbedingte Prozesse, die gleichzeitig ablaufen:

1. Analytmoleküle werden zur Oberfläche des Partikels und um dieses Partikel herum transportiert [Eddy-Diffusion]
2. Analytmoleküle diffundieren in der mobilen Phase vor und zurück [Längsdiffusion]
3. Analytmoleküle diffundieren in die chromatographischen Poren und aus diesen heraus [Massentransfer].

Diese diffusionsbedingten Prozesse können mathematisch in Form der Van-Deemter-Gleichung ausgedrückt werden.

Die Van-Deemter-Gleichung besteht aus drei Termen:

• Der A-Term [Eddy-Diffusion] hängt hauptsächlich von der Partikelgröße des Packungsmaterials ab. Sein Wert wird auch dadurch bestimmt, wie gut das Chromatographiebett gepackt ist. Er hängt auch von der Gleichmäßigkeit oder Ungleichmäßigkeit des Flusses zu und um ein Partikel herum ab.
• Der B-Term [Längsdiffusion] hängt von der Diffusion des Analyten in der mobilen Phase und in der stationären Phase ab und nimmt mit steigender Geschwindigkeit der mobilen Phase [Lineargeschwindigkeit] ab.
• Der C-Term [Massentransfer] hängt sowohl von der Lineargeschwindigkeit [die Geschwindigkeit der mobilen Phase] als auch vom Quadrat der Partikelgröße ab. Massentransfer ist die Wechselwirkung von Analytmolekülen mit der inneren Oberfläche der stationären Phase und ihrer Diffusionsstrecke in die und aus den Poren des Packungsmaterials.

Wir können diese Terme einzeln betrachten, indem wir sie auf einer Skala von HETP gegen die lineare Geschwindigkeit [u] der mobilen Phase auftragen [Abbildung 24].

Der A-Term wird als horizontale Linie dargestellt. Er hängt von der Partikelgröße und der Packungsdichte einer Säule ab und ist unabhängig von der Lineargeschwindigkeit [Geschwindigkeit der mobilen Phase]. Mit abnehmender Partikelgröße des Packungsmaterials nimmt auch der H-Wert ab [höhere Effizienz].

Der B-Term ist als abfallende Kurve mit zunehmender Lineargeschwindigkeit dargestellt. Dieser Term ist unabhängig von der Partikelgröße und gibt an, dass, wenn sich die mobile Phase mit einer langsameren Lineargeschwindigkeit bewegt, die Analytmoleküle länger in der Säule bleiben und daher eine größere Gelegenheit zur Bandenverbreiterung [Diffusion] in Längsrichtung innerhalb der Säule besteht. Umgekehrt bleibt, wenn sich die mobile Phase mit einer höheren Lineargeschwindigkeit bewegt, weniger Zeit für die Diffusion und damit für die Bandenverbreiterung.

Der C-Term wird als zunehmende lineare Beziehung zwischen H und u dargestellt. Unter einer Verteilung von Molekülen treten einige Moleküle in eine Pore der stationären Phase ein, während andere in der beweglichen mobilen Phase bleiben, bis sie ein anderes Partikel erreichen. Darauf folgt der umgekehrte Prozess, bei dem sich immobilisierte Moleküle ablösen und sich im Chromatographiebett weiter nach unten bewegen. Es dauert eine gewisse Zeit, bis sich ein Molekül in die Poren und aus ihnen heraus bewegt hat. Daher wird die Analytbande, die diese Moleküle enthält, über die Länge der Säule verbreitert, wenn Moleküle von einem Partikel zum nächsten übertragen werden. Je kleiner die Partikel der stationären Phase sind, desto schneller läuft dieser Prozess ab und verhindert, dass sich die Analytbande verbreitert. Wenn sich die mobile Phase schnell bewegt, entsteht ein größerer Abstand zwischen den immobilisierten Molekülen und denen, die sich vorwärts bewegen. Dies weist darauf hin, dass sich die mobile Phase mit einer langsameren Lineargeschwindigkeit bewegen sollte, damit die Population der Analytmoleküle zusammenbleibt. Wenn die Geschwindigkeit der mobilen Phase erhöht wird, wird die Population der Analytmoleküle disperser, was zu einer stärkeren Bandenverbreiterung führt.

Eine Van-Deemter-Kurve wird durch Addition der Terme A, B und C gebildet [Abbildung 25]. Die Trennung bei der Lineargeschwindigkeit, bei der der niedrigste Punkt der Kurve auftritt, führt zur höchsten Effizienz und damit zur höchsten chromatographischen Auflösung.

Wenn wir dies mit der in Abbildung 23 gezeigten Van-Deemter-Gleichung korrelieren, wird H um den Faktor 2 reduziert, wenn die Partikelgröße um die Hälfte reduziert wird. Daher ist es möglich, die Bandenverbreiterung innerhalb einer Säule durch Verwendung kleinerer Partikel zu reduzieren.

Abbildung 26 zeigt zum Beispiel ein Van-Deemter-Diagramm eines 10-µm-Partikels und eines 5-µm-Partikels. Wie aus dem Diagramm ersichtlich ist, hat ein großes Partikel von 10 µm in Bezug auf die Lineargeschwindigkeit einen sehr engen optimalen Betriebsbereich, um den niedrigsten H-Wert zu erreichen [18 µm bei 0,7 mm/s]. Wenn die Geschwindigkeit der mobilen Phase zu langsam oder zu hoch ist, wird ein Anstieg von H [Effizienzverlust] beobachtet, wodurch die chromatographische Auflösung und Empfindlichkeit verringert wird. Jedoch weist das 5-µm-Partikel einen viel niedrigeren H-Wert [10 µm bei 0,95 mm/s; höhere Effizienz] bei einer höheren Geschwindigkeit der mobilen Phase sowie einem größeren Lineargeschwindigkeitsbereich auf, in dem dieser H-Wert erreicht werden kann. Dies bedeutet, dass eine höhere Effizienz und damit Auflösung in kürzerer Zeit erreicht werden kann als mit einer Säule, die mit größeren 10-µm-Partikeln gepackt ist.

Um diesen Effekt besser zu verstehen, können wir den Einfluss der Partikelgröße auf die einzelnen Terme der Van-Deemter-Gleichung weiter untersuchen.

Die Partikelgröße hat einen signifikanten Einfluss auf die Analytbande, da sie mit dem A-Term [Eddy-Diffusion] zusammenhängt. Der Weg, den Analytmoleküle zurücklegen, um von der mobilen Phase zur Partikeloberfläche und um diesen Partikel herum zu gelangen, nimmt mit abnehmender Partikelgröße weniger Zeit in Anspruch. Größere Partikel bewirken, dass Analytmoleküle längere, indirektere Wege zurücklegen. Die Unterschiede in diesen Wegen führen zu unterschiedlichen Migrationszeiten für die Analytmoleküle innerhalb einer Population, was zu einer breiteren Analytbande und einem entsprechenden Peak führt. Je kleiner die Partikelgröße der Packung, desto ähnlicher die Wege der Analytmoleküle. Dies führt zu schmaleren Analytbanden, was sich in schmaleren Peaks, höherer Effizienz und höherer Empfindlichkeit niederschlägt [Abbildung 27].

Die Längsdiffusion, der B-Term, wird nicht direkt durch die Partikelgröße beeinflusst. Mit abnehmender Partikelgröße werden jedoch die anderen Parameter der Van-Deemter-Gleichung, der A- und der C-Term, kleiner. Folglich nimmt die optimale Lineargeschwindigkeit [Geschwindigkeit der mobilen Phase] zu, wodurch sich die Gelegenheit für Bandenverbreiterung verringert. Eine geringere Lineargeschwindigkeit ermöglicht es der Bande der Analytmoleküle, über einen längeren Zeitraum mit dem Packungsmaterial zu interagieren. Dies bedeutet, dass mehr Zeit für die axiale [Längs-]Diffusion in die mobile Phase bleibt, was zu breiteren, diffuseren Analytbanden führt. Bei höherer Lineargeschwindigkeit wird die Population der Analytmoleküle in kürzerer Zeit durch die Säule gespült, wodurch die Analytbande konzentrierter bleiben kann, was zu schmaleren Peaks mit höherer Effizienz führt, da die Längsdiffusion weniger Zeit hat [Abbildung 28].

Der C-Term [Massentransfer] wird sowohl durch die Lineargeschwindigkeit als auch die Partikelgröße beeinflusst. Die Populationen der Analytmoleküle werden von der mobilen Phase zur Partikeloberfläche transportiert. Die Analytmoleküle bewegen sich dann durch die mobile Phase in den Poren zur gebundenen Oberflächenschicht (z. B. C₁₈, C₈ usw.), interagieren mit der gebundenen Phase und werden dann wieder aus der Pore in die mobile Phase gespült. Die Analytmoleküle innerhalb der Population bewegen sich jedoch in unterschiedlichem Maße in die Pore hinein und aus dieser heraus. Das bedeutet, dass bei der Rückkehr der Moleküle in die mobile Phase die Länge des Weges, den jedes Analytmolekül zurückgelegt hat, unterschiedlich ist, was zu einer Verbreiterung [Ausdehnung] der Analytbande führt [Abbildung 29]. Das Ausmaß der auftretenden Bandenverbreiterung hängt von der Geschwindigkeit der mobilen Phase ab [Abbildung 30].

Bei einer hohen Lineargeschwindigkeit ist die Zeit zwischen der Interaktion der Moleküle mit der Partikeloberfläche und dem Transfer durch die mobile Phase länger. Je schneller die mobile Phase ist, desto schneller bewegen sich die Analytmoleküle durch die Säule, was zu einer breiteren, weniger konzentrierten Analytbande führt. Dies führt zu einem breiteren chromatographischen Peak und einer geringeren Empfindlichkeit.

Bei einer geringen Lineargeschwindigkeit ist die Länge der Schritte zwischen den Wechselwirkungen zur Oberfläche kürzer. Dies führt zu einer konzentrierteren Analytbande, wodurch schmalere und effizientere chromatographische Peaks erzeugt werden.

Der Massentransfer verbessert sich aufgrund seiner Beziehung zum Quadrat der Partikelgröße [d_p²] drastisch, wenn die Partikelgröße verringert wird. Bei kleineren Partikeln dauert es weniger Zeit, bis ein Analytmolekül in die Poren gelangt, mit der chromatographischen Oberfläche interagiert und wieder in die mobile Phase zurückgespült wird. Daher diffundieren Analytmoleküle, die auf Säulen mit kleineren Partikeln getrennt werden, viel schneller, was zu einer schärferen, schmaleren und effizienteren chromatographischen Bande führt [Abbildung 31].

Eine Verringerung der Partikelgröße verbessert daher den Massentransfer und verringert so effektiv die Steigung des C-Terms, was uns an den Punkt führt, an dem wir heute bei der UPLC-Technologie stehen. Wie im Van-Deemter-Diagramm in Abbildung 32 zu sehen ist, liefern 1,7-µm-Partikel um 2 bis 3 ´ niedrigere HETP-Werte als 3,5-µm-Partikel. Darüber hinaus werden diese niedrigeren H-Werte bei einer höheren Lineargeschwindigkeit und über einen breiteren Geschwindigkeitsbereich erreicht. Dies bedeutet, dass der Massentransfer mit den kleineren Partikeln drastisch verbessert wird, was eine bessere Effizienz und Auflösung ermöglicht. Dies bedeutet auch, dass ein größerer Bereich von Lineargeschwindigkeiten verwendet werden kann, um diese verbesserte Leistung zu erzielen. Trennungen können bei höheren Lineargeschwindigkeiten durchgeführt werden, wodurch die Analysegeschwindigkeit verbessert wird, ohne die Auflösung zu beeinträchtigen.

Der Einfluss der Bandenverbreiterung außerhalb der Säule [vom Gerät] auf Van-Deemter-Diagramme

Mit zunehmender Dynamik und Popularität der UPLC-Technologie im chromatographischen Labor haben sich Van-Deemter-Diagramme als eine gängige Methode zur Messung der Leistungssteigerung von Sub-2-µm-Partikeln im Vergleich zu vorhandenen HPLC-Partikeln etabliert. Wenn diese Vergleichsmessungen nicht an Geräten durchgeführt werden, die den Beitrag der Bandenverbreiterung außerhalb der Säule minimieren, können falsche Schlussfolgerungen gezogen werden.

Um die Bedeutung der Bandenverbreiterung außerhalb der Säule bei der Leistungsmessung zu veranschaulichen, wurden Van-Deemter-Diagramme auf einem herkömmlichen HPLC-Gerät erstellt [Bandenverbreiterung = 7,2 µL], wobei Partikel mit 1,7 µm mit Partikeln mit 2,5 µm verglichen wurden [Abbildung 33]. Das Partikelsubstrat und die Chemie der gebundenen Phase der beiden Säulen waren identisch. Auf den ersten Blick lassen die Van-Deemter-Diagramme keinen merklichen Unterschied in der Leistung dieser beiden Säulen erkennen. Wie kann das sein?

In diesem Fall führt die Bandenverbreiterung des HPLC-Geräts zu einer ähnlichen Leistungsmessung der UPLC-Säule mit 1,7-µm-Partikeln im Vergleich zur HPLC-Säule mit 2,5 µm. Die kleineren Peakbreiten, die von UPLC-Säulen mit 1,7-µm-Partikeln erzeugt werden, werden von einer Bandenverbreiterung außerhalb der Säule stärker beeinflusst als Säulen, die mit größeren Partikeln [z. B. 2,5 µm] gepackt sind, wodurch dieses irreführende Ergebnis erzeugt wird.

Das gleiche Experiment wurde dann mit einem ACQUITY UPLC System durchgeführt [Bandenverbreiterung = 2,8 µL]. Das ACQUITY UPLC System hat ein ca. 84 % geringeres Systemvolumen und eine 60 % geringere Bandenverbreiterung als das HPLC-Gerät.

Wie in Abbildung 34 zu sehen ist, ist ein merklicher Unterschied in der Leistung dieser beiden Säulen beim Betrieb mit dem ACQUITY UPLC System zu beobachten. Zusätzlich zu den beobachteten Unterschieden bei HETP steigt die optimale Lineargeschwindigkeit von 3,0 mm/s [2,5-µm-Partikel] auf 10,0 mm/s [1,7-µm-Partikel], was die Leistungssteigerungen einer niedrigeren HETP [höhere Effizienz] und einer schnelleren Lineargeschwindigkeit [und damit eines höheren Durchsatz] in Verbindung mit der UPLC-Technologie zeigt.

Aufrechterhaltung der Funktionsweise der Trennung ohne Kompromisse

Nachdem nun ein grundlegendes Verständnis der Funktionen der Bandenverbreiterung außerhalb und innerhalb der Säule gewonnen wurde, können wir das Maß dieser Terme [HETP vs. lineare Geschwindigkeit] auf eine praktischere Weise in Beziehung setzen: Bodenzahl vs. Flussrate.

Wie bereits erwähnt, ist die Lineargeschwindigkeit die Geschwindigkeit der mobilen Phase, wenn diese durch die Säule fließt. Mit diesem Begriff wird die Flussrate der mobilen Phase unabhängig vom Säulen-ID normalisiert, sodass die Leistung von Säulen mit unterschiedlichen Abmessungen gemessen und verglichen werden kann. Die optimale Lineargeschwindigkeit steht in direktem Zusammenhang mit der optimalen Flussrate [Abbildung 35]. Herkömmliche HPLC-Säulen können nur in einem engen Flussratenbereich betrieben werden, um eine optimale Leistung zu erzielen. Bei Betrieb außerhalb dieses Bereichs ist mit Leistungseinbußen zu rechnen.

Ein gängiger Ansatz zur Verkürzung der Analysezeit [Verbesserung des Durchsatzes] bei der herkömmlichen HPLC besteht darin, einfach die Flussrate zu erhöhen. Bei größeren Partikeln führt eine Erhöhung der Flussrate oft zu einem erheblichen Verlust an Effizienz und damit an Auflösung, da jetzt über der optimalen Lineargeschwindigkeit für HPLC-Partikel [komprimierte Chromatographie] gearbeitet wird. Dies ist ein bedeutender Kompromiss zwischen chromatographischer Leistung und Analysegeschwindigkeit, der mit HPLC verbunden ist [Abbildung 36].

Die UPLC-Technologie ist nicht anfällig für diese Kompromisse. Die Analysezeit kann ohne Leistungseinbußen verkürzt werden. Wenn die Partikelgröße von 3,5 µm auf 1,7 µm reduziert wird, ist eine signifikante Effizienzsteigerung zu beobachten [Abbildung 37]. Dies liegt an den schmalen chromatographischen Banden, die von UPLC-Säulen mit 1,7-µm-Partikeln aufgrund der vernachlässigbaren Bandenverbreiterung innerhalb der Säule erzeugt werden. Außerdem tritt diese zusätzliche Effizienz bei einer höheren Flussrate auf [Abbildung 37]. Dies bedeutet, dass bei gleicher Säulenlänge eine drastische Steigerung der Effizienz und damit der Auflösung in kürzerer Analysezeit erreicht werden kann.

Die Trennleistung einer Säule [L/dp] verstehen

Beim Durchführen einer chromatographischen Trennung besteht das Hauptziel darin, eine Komponente von einer anderen zu trennen, um einige oder alle Komponenten messen zu können. Die maximale Trennleistung einer Säule lässt sich schätzen, indem man die Säulenlänge (L) durch die Partikelgröße [d_p] dividiert. Das L/d_p-Verhältnis ist insbesondere dann hilfreich, wenn man versucht herauszufinden, welche Partikelgröße für Packungsmaterialien und welche Säulenlänge für eine bestimmte Applikation notwendig ist [Abbildung 38].

Dieses Verhältnis kann auch als Hilfsmittel für die Übertragung von Methoden von einer Partikelgröße auf eine andere verwendet werden. Eine Säule mit einem L/d_p-Verhältnis von 30.000 [mäßig anspruchsvolle Trennung] ist eine sehr gängige Wahl. Wie in Abbildung 39 zu sehen, ist eine typische HPLC-Säule mit einer Trennleistung von 30.000 150 mm lang und mit 5-µm-Partikeln gepackt. Mit abnehmender Partikelgröße kann dieselbe Trennleistung in einer kürzeren Säule erreicht werden [was eine schnellere Analysezeit bedeutet; d.h. eine 50 mm lange Säule, die mit 1,7-µm-Partikeln gepackt ist, erreicht ein L/d_p-Verhältnis von 30.000]. Neben einer kürzeren Säulenlänge nimmt mit abnehmender Partikelgröße auch die optimale Flussrate zu, was die Analysedauer weiter verkürzt.

Das lässt sich chromatographisch besser veranschaulichen [Abbildung 40]. Eine 50 mm lange UPLC-Säule mit 1,7-µm-Partikeln liefert dieselbe Trennleistung wie eine 150 mm lange HPLC-Säule mit 5-µm-Partikeln. Wenn das L/d_p-Verhältnis konstant bleibt, wird die Analysezeit um 10 ´ verkürzt, während die Auflösung gleich bleibt. Die Flussraten wurden umgekehrt proportional zu jeder Partikelgröße eingestellt. Die Injektionsvolumina wurden proportional zum Säulenvolumen skaliert, sodass dieselbe Massenbeladbarkeit auf der Säule injiziert wurde.

Das Verständnis der Rolle des Verhältnisses von Säulenlänge zu Partikelgröße [L/d_p] ist entscheidend für das Verständnis der UPLC-Technologie. Die UPLC-Technologie basiert auf dem effizienten Packen kleiner, drucktoleranter Partikel in kurze [hoher Durchsatz] oder lange [hohe Auflösung] Säulen. Diese UPLC-Säulen werden in einem LC-Gerät verwendet, das für den Betrieb bei der optimalen Lineargeschwindigkeit [und dem entsprechenden Druck] für diese Partikel mit minimaler Bandenverbreiterung ausgelegt ist.

Messen der Gradiententrennleistung [Peakkapazität]

Unter isokratischen Bedingungen ist die Bodenzahl [N] ein Maß für die kumulativen Bandenverbreiterungsbeiträge des Geräts und der Säule. Aufgrund der diffusionsbedingten Bandenverbreiterung nimmt die Breite einer Analytbande zu, je länger die Analytbande auf der stationären Phase gehalten wird.

Bei einem Gradientenlauf ändert sich die Elutionsstärke der mobilen Phase im Laufe der Analyse. Dies führt dazu, dass sich stärker zurückgehaltene Analytbanden schneller durch die Säule bewegen [und sich somit die Retentionszeit ändert], wodurch die Banden konzentrierter [schmal] gehalten werden. Bei der Reversed-Phase-Chromatographie steuert die zunehmende Elutionsstärke der mobilen Phase die Breite der erzeugten Banden, was zu ähnlichen Peakbreiten beim Durchgang der Banden durch den Detektor führt. Da sich die Peakbreite und Retentionszeit durch die Stärke der mobilen Phase ändern, ist die Bodenzahl [aufgrund ihrer Beziehung zur Peakbreite] kein gültiges Maß für Gradiententrennungen.

Die Trennleistung eines Gradienten kann anhand seiner Peakkapazität [P_c] berechnet werden. Daher ist die Peakkapazität einfach die theoretische Anzahl von Peaks, die in einer gegebenen Gradientenzeit getrennt werden können. Die Peakkapazität ist umgekehrt proportional zur Peakbreite. Damit P_c zunimmt, muss die Peakbreite daher abnehmen.

Die Peakkapazität kann durch den Einsatz der UPLC-Technologie drastisch erhöht werden. Das hohe Trennleistung der UPLC-Technologie ermöglicht es, mehr Informationen pro Zeiteinheit zu erzeugen, indem die Leistung von Sub-2-µm-Partikeln auf Geräten mit außergewöhnlich niedriger Dispersion [2,8 µL Bandenverbreiterung] genutzt wird. Dadurch können mehr Informationen aus einer gegebenen Probe gesammelt werden. Zum Beispiel liefert ein Trypsinverdau von Phosphorylase b ~70 identifizierte Peaks unter Verwendung einer HPLC-Säule, die mit 5-µm-Partikeln gepackt ist [Abbildung 43A]. Mit der UPLC-Technologie steigt die Anzahl der identifizierbaren Peaks von 70 auf 168, wodurch das Vertrauen in die Proteinidentifizierung verbessert wird [Abbildung 43B].