Leitfaden zu UPLC

Nach Verständnis der in diesem Leitfaden beschriebenen chromatographischen Grundlagen und ihrer Anwendung wird deutlich, dass zur Maximierung der Trennleistung mehr als nur kleine Partikel und höherer Druck berücksichtigt werden müssen. Um den chromatographischen Vorteil von Säulen mit Sub-2-µm-Partikeln zu nutzen, müssen diese Säulen an einem Gerät betrieben werden, das speziell für den von kleineren Partikeln erzeugten Druck ausgelegt ist, und die Bandenverbreiterung minimiert werden. Dies ist mit herkömmlichen HPLC-Systemen nicht zu erreichen.

Das ACQUITY UltraPerformance LC System ist eine ganzheitlich konzipierte Lösung, die die Leistung und Analysedatenqualität chromatographischer Trennungen verbessert, indem alle Aspekte des Geräte- und Säulendesigns berücksichtigt werden.

Es sollte nun klar sein, dass der Schlüssel zu UPLC-Trennungen die Kombination aus Geräte- und Säulenleistung ist, die es Chromatographieanwendern ermöglicht, die Leistung von Säulen mit Sub-2-µm-Partikeln voll auszuschöpfen und zu nutzen. Dies wird durch Minimierung der Bandenverbreiterung innerhalb und außerhalb der Säule und durch den Betrieb bei den optimalen Lineargeschwindigkeiten [und Drücken] dieser Säulen mit kleinen Partikeln erreicht [Abbildung 51].

Maximieren der Trennleistung

Zur Maximierung der Trennleistung kann die Verwendung kleiner Partikel mit erhöhter Temperatur und erhöhtem Druck kombiniert werden, um mithilfe der UPLC-Technologie ultra-hocheffiziente Trennungen zu entwickeln.

Abbildung 52A zeigt eine einzelne, 150 mm lange UPLC-Säule mit 1,7 µm, die bei 90 °C knapp 40.000 Böden produziert. Eine zweite Säule wurde in Reihe hinzugefügt, um eine Länge von 300 mm zu erreichen, was eine Bodenzahl von 83.000 ergab [Abbildung 52B]. Der volle Druckbereich des ACQUITY UPLC Systems wird durch Hinzufügen einer dritten Säule in Reihe ausgenutzt, wodurch eine 450 mm lange UPLC-Säule entsteht, die mit 1,7-µm-Partikeln gepackt ist. Wie in Abbildung 52C zu sehen ist, wird eine Effizienz von 121.000 Böden in nur 8 Minuten erreicht.

Die Gradiententrennleistung kann auch unter Verwendung der gleichen Logik erhöht werden. In diesem Beispiel wurden zwei 150 mm lange, 1,7-µm-UPLC-Säulen [Gesamtlänge 300 mm] in Reihe verbunden, um die für die Metabolitenidentifizierung erhaltenen Informationen drastisch zu verbessern [Abbildung 53]. Innerhalb einer Laufzeit von einer Stunde wurde eine Peakkapazität von über 1000 erreicht. Die Möglichkeit, diese Urinprobe vollständig zu charakterisieren, ermöglicht die Identifizierung von Metaboliten von Arzneimittelkandidaten, den Nachweis und die Identifizierung von Toxizitätsmarkern und den Nachweis von Toxinen beim Monitoring therapeutischer Arzneimittel. In diesem Fall wird die Trennleistung und damit die massenspektrale Qualität erheblich verbessert, was zu einer vereinfachten Datenanalyse, verbesserten Nachweisgrenzen und einer höheren Zuverlässigkeit des Assays führt.

Ein einziges System für HPLC- und UPLC-Trennungen

Das ACQUITY UPLC System wurde entwickelt, um die zunehmenden organisatorischen Herausforderungen zu meistern, Produkte schneller auf den Markt zu bringen und gleichzeitig die Qualität der Informationen aufrechtzuerhalten oder zu verbessern. Seit 2004 haben zahlreiche Unternehmen die UPLC-Technologie als routinemäßige Analyseplattform eingeführt und damit die herkömmliche HPLC ersetzt.

Bei der Einführung einer neuen Technologie ist es wichtig, ihre Funktionalität zu überdenken, damit bestehende und künftige Anforderungen erfüllt werden. Die UPLC-Technologie ermöglicht eine Investition in die Zukunft: Ein einziges System garantiert den optimalen Einsatz mit Sub-2-μm-Säulen und bietet gleichzeitig die Robustheit zum Durchführen von bestehenden HPLC-Methoden. Dies bedeutet, dass unabhängig von den Trennanforderungen eine einzige Technologieplattform verwendet werden kann, was eine höhere Produktivität ermöglicht, indem der Methodentransfer von einem Labor zu einem anderen vereinfacht wird.

Abbildung 54 zeigt ein Beispiel, wie das ACQUITY UPLC System als Standard-HPLC betrieben werden kann. Dies ist die USP-Methode für Excedrin [rezeptfreies Schmerzmittel], die auf einem herkömmlichen HPLC-System [Abbildung 54A] und auf einem ACQUITY UPLC System [Abbildung 54B] durchgeführt wird. Die Chromatographiemethode, die mobilen Phasen, die Probe und die Säule wurden einfach von einem Gerät auf das andere übertragen. Als Ergebnis des optimalen Systemdesigns werden für dasselbe Assay auf dem ACQUITY UPLC System ohne Änderung der Selektivität oder der relativen Retention eine höhere Effizienz und Empfindlichkeit beobachtet.

Zusammenfassung

Dieser Leitfaden vermittelt dem Leser ein grundlegendes Verständnis der chromatographischen Prinzipien, auf denen die UPLC-Technologie basiert. Wir hoffen, dass der Leser nun die erheblichen Verbesserungen bei Auflösung, Empfindlichkeit und Geschwindigkeit versteht, die bei chromatographischen Trennungen durch Minimierung der Beiträge der Bandenverbreiterung sowohl des Geräts als auch der Säule erreicht werden können. Zusätzlich zu einer minimalen Bandenverbreiterung muss ein solches System in der Lage sein, bei der optimalen Lineargeschwindigkeit [und dem optimalen Druck] für Säulen mit kleinen Partikeln [unter 2 µm] zu arbeiten. Das ACQUITY UPLC System wurde entwickelt, um die aktuellen und zukünftigen Anforderungen von Wissenschaftlern in Chromatographielaboren zu erfüllen.

Die in diesem Leitfaden beschriebenen theoretischen Effizienz- und Auflösungsgewinne wurden vor Jahrzehnten vorhergesagt. Mit der Einführung des ACQUITY UPLC Systems im Jahr 2004 wurde die Theorie zum ersten Mal im kommerziellen Maßstab umgesetzt. Seither nutzen viele tausend Wissenschaftler in Chromatographielaboren auf der ganzen Welt die UPLC-Technologie und die praktischen Vorteile, die sie für deren Unternehmen bieten kann. Das ACQUITY UPLC System ermöglicht Unternehmen eine effektivere Verwaltung der Unternehmenswerte, indem die Qualität der chromatographischen Informationen verbessert und der Zeitaufwand für die Erfassung dieser Informationen verringert wird. Dies fördert die Produktivität des Unternehmens, indem viele der Herausforderungen und Engpässe im Labor für analytische Trennungen überwunden werden. Neben offensichtlichen und erheblichen Kosteneinsparungen bei Verbrauchsmaterialien kommen kürzere, zuverlässigere Trennungen auch der Umwelt zugute, da deutlich geringere Mengen an organischen Lösungsmitteln benötigt werden. 

Interessanterweise haben die meisten führenden Gerätehersteller, die ursprünglich die Bedeutung eines Chromatographiesystems für höhere Drücke heruntergespielt haben [unter Verweis auf Bedenken bezüglich der Sicherheit, Robustheit, Probenkompatibilität usw. ], nun die Notwendigkeit einer solchen LC-Plattform durch die Entwicklung verschiedener eigener Systeme, die für höhere Drücke geeignet sind, validiert. Obwohl diese Systeme einige Kompromisse beinhalten [z. B. niedrigere Druckgrenzwerte, große Bandenverbreiterung, begrenzte Detektionsoptionen usw.], weist dieser eindeutige Trend zu einer höheren chromatographischen Leistung darauf hin, dass die Chromatographie noch immer Fortschritte macht.

Weiterführende Literatur:

1. U.D. Neue, „HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice“, Wiley-VCH [1997]
2. J.C. Aresenault und P.D. McDonald, „Beginners Guide to Liquid Chromatography“, Waters [2009]
3. P.D. McDonald, „The Quest for Ultra Performance in Liquid Chromatography: Origins of UPLC Technology“, Waters [2009]
4. M.P. Balogh, „The Mass Spectrometry Primer“, Waters [2009]