Leitfaden zu SPE

SPE ist Chromatographie

Beachten Sie, dass die Festphasenextraktion auf den gleichen Grundlagen wie die HPLC beruht. Die Kenntnis des chromatographischen Verhaltens der nachzuweisenden Analyten und anderer Matrixkomponenten kann bei der Auswahl des geeigneten Sorbens und der geeigneten Eluenten helfen. Wenn Sie zum Beispiel wissen, dass bestimmte chromatographische Bedingungen Ihren Analyten hervorragend vor Störungen schützen, können Sie eine ähnliche Kombination aus SPE-Sorbens und Lösungsmittel wählen. Ebenso wissen Sie von vornherein, dass ähnliche SPE-Bedingungen nicht erfolgreich sind, wenn Sie versuchen, eine bei der HPLC koeluierende Interferenz zu entfernen.

Allgemeine Elutionsprotokolle

Es gibt zwei allgemeine Strategien für die Trennung und Aufreinigung von interessierenden Probenkomponenten:

• Adsorbieren von Matrixinterferenzen, während interessierende Komponenten die Kartusche passieren und dabei nicht zurückgehalten werden
• Adsorbieren von interessierenden Komponenten, während Matrixinterferenzen die Kartusche passieren und dabei nicht zurückgehalten werden

Die erste Strategie wird normalerweise gewählt, wenn die gewünschte Probenkomponente in hoher Konzentration vorhanden ist. Wenn die interessierenden Komponenten in geringen Mengen vorhanden sind oder mehrere Komponenten mit sehr unterschiedlichen Polaritäten getrennt werden müssen, wird im Allgemeinen die zweite Strategie angewandt. Die Spurenanreicherung von Verbindungen, die in extrem geringen Mengen vorhanden sind, und die Konzentration verdünnter Proben werden auch durch die zweite Strategie erreicht.

Schritte einer Festphasenextraktion

Im folgenden Abschnitt werden die Schritte einer vollständigen Festphasenextraktion beschrieben. Bei vielen Applikationen können ein oder mehrere der unten aufgeführten und nachfolgend anhand allgemeiner Beispiele beschriebenen Schritte entfallen, wodurch das Verfahren vereinfacht wird. Bei den hier dargestellten Verfahren werden Proben verwendet, die Farbstoffe enthalten, sodass die Trennungen leicht sichtbar gemacht werden können. Denken Sie daran, dass die meisten Proben farblose Komponenten enthalten, für die ein Detektor oder ein Test erforderlich ist, um sie in den gesammelten Fraktionen zu finden. Verwenden Sie die folgenden Informationen als Leitfaden bei der Entwicklung Ihres eigenen Verfahrens oder beim Modifizieren von in der Literatur veröffentlichten Verfahren.

1. 1. Vorbehandlung der Probe
2. 2. Konditionierung der Kartusche
3. 3. Laden der Probe
4. 4. Elution der Fraktionen

Normalphasenchromatographie

Dieser Modus wird klassischerweise zur Trennung neutraler organischer Verbindungen verwendet, deren chemischer Charakter von hydrophob bis mäßig polar reicht.

Für die Normalphasenchromatographie mit SPE-Kartuschen verwenden Sie einen Stufengradienten aus unpolaren Lösungsmitteln mit einem polaren Packungsmaterial.

1. 1. Konditionieren Sie die Kartusche mit sechs bis zehn Rückhaltevolumina eines unpolaren Lösungsmittels, normalerweise ist dies das Lösungsmittel, in dem die Probe gelöst ist.
2. 2. Geben Sie die Probenlösung auf das Kartuschenbett.
3. 3. Eluieren Sie unerwünschte Komponenten mit einem unpolaren Lösungsmittel.
4. 4. Die erste interessierende Komponente wird mit einem polareren Lösungsmittel eluiert.
5. 4. Die verbleibenden interessierenden Komponenten werden mit zunehmend polareren [stärkeren] Lösungsmitteln eluiert.
6. 6. Wenn Sie alle Komponenten wiedergewonnen haben, entsorgen Sie die gebrauchte Kartusche auf sichere und angemessene Weise.

Dieses Verfahren wird in der nachstehenden Abbildung für eine Probe veranschaulicht, die eine Mischung aus drei neutralen, relativ unpolaren organischen Farbstoffen [gelb, rot und blau] enthält, die bei der ersten Beladung des Kartuschenbetts schwarz erscheint.

Abbildung eines allgemeinen Elutionsprotokolls für die Normalphasenchromatographie auf SPE-Kartuschen
(Silika, Florisil, Aluminiumoxid, Diol, CN, NH₂)

Umkehrphasenchromatographie

Aufgrund der Vielzahl wässriger Proben, die ein breites Spektrum von Applikationen abdecken, von Wasser bis zu Obst und Gemüse und von Getränken bis zu biologischen Flüssigkeiten, hat sich die Umkehrphasenchromatographie zum vorherrschenden SPE-Verfahren entwickelt.

Für die Umkehrphasenchromatographie mit SPE-Kartuschen verwenden Sie einen Gradienten von stark bis schwach polaren Lösungsmitteln [von schwacher bis starker Lösungsmittel-Elutionsstärke] mit einem unpolaren Packungsmaterial.

1. 1. Konditionieren Sie die silikagebundene Phase oder die Polymerpackung mit sechs bis zehn Rückhaltevolumina Methanol oder Acetonitril. Spülen Sie die Kartusche mit sechs bis zehn Rückhaltevolumina Wasser oder Puffer. Lassen Sie die Kartusche nicht austrocknen [außer bei Verwendung von HLB].
2. 2. Laden Sie die Probe, die in einem stark polaren [schwachen] Lösungsmittel [üblicherweise Wasser] gelöst ist.
3. 3. Eluieren Sie unerwünschte Komponenten mit einem stark polaren Lösungsmittel.
4. 4. Eluieren Sie schwach zurückgehaltene, interessierende Komponenten mit einem weniger polaren Lösungsmittel.
5. 5. Stärker gebundene Komponenten werden mit zunehmend unpolareren [stärkeren] Lösungsmitteln eluiert.
6. 6. Wenn Sie alle interessierenden Komponenten wiedergefunden haben, entsorgen Sie die gebrauchte Kartusche auf sichere und angemessene Weise.

Dieses Verfahren wird in der folgenden Abbildung für eine Probe eines wässrigen Traubengetränks veranschaulicht, das zwei polare Lebensmittelfarbstoffe [rot und blau] sowie Zucker und künstliches Aroma [aber keinen echten Traubensaft!] enthält. Nach der Zubereitung erscheint dieses Getränk im Glas hellviolett, da die Farbstoffkonzentration verdünnt ist. Wenn eine Portion auf eine vorbereitete SPE-Kartusche geladen wird, konzentrieren sich die stark zurückgehaltenen Farbstoffe in der Nähe des Einlasses in einer dunkelvioletten Bande.

Abbildung eines allgemeinen Elutionsprotokolls für die Umkehrphasenchromatographie auf SPE-Kartuschen
(C₁₈, tC₁₈, C₈, CN, Diol, HLB, Porapak RDX, NH₂)

Ionenaustauschchromatographie

Verbindungen, die ionisch oder ionisierbar sind, lassen sich oft am besten durch irgendeine Form der Ionenaustauschchromatographie trennen. Dieser Trennmodus ist orthogonal zu den häufiger verwendeten Normalphasen- und Umkehrphasenmodi und bietet eine leistungsstarke, selektive zweite Dimension der Probenvorbereitungsprotokolle.

Abbildung der zwei wichtigsten Phasentypen – Anionen- und Kationenaustausch –
und wie sie Moleküle mit entgegengesetzter Ladung selektiv anziehen und zurückhalten

Für die Ionenaustauschchromatographie mit SPE-Kartuschen verwenden Sie einen Gradienten des pH-Werts oder der Ionenstärke mit einem Ionenaustauschpackungsmaterial.

1. 1. Konditionieren Sie die Kartusche mit sechs bis zehn Rückhaltevolumina entionisiertem Wasser oder schwachem Puffer.
2. 2. Laden Sie die Probe, die in einer Lösung aus entionisiertem Wasser oder Puffer gelöst ist.
3. 3. Eluieren Sie unerwünschte, schwach gebundene Komponenten mit einem schwachen Puffer.
4. 4. Eluieren Sie die erste interessierende Komponente mit einem stärkeren Puffer (ändern Sie den pH-Wert oder die Ionenstärke).
5. 5. Eluieren Sie andere Komponenten mit zunehmend stärkeren Puffern.
6. 6. Wenn Sie alle Komponenten wiedergewonnen haben, entsorgen Sie die gebrauchte Kartusche auf geeignete Weise.

Dieses Verfahren wird in der folgenden Abbildung für eine Probe einer wässrigen Mischung aus zwei ionischen Farbstoffen mit unterschiedlichen pK_a-Werten veranschaulicht. Beim Laden auf die Kartusche werden beide Komponenten stark zurückgehalten und die Kombination aus blauen und gelben Komponenten erscheint als grüne Bande in der Nähe des Einlasses.

Abbildung des allgemeinen Elutionsprotokolls für die Ionenaustauschchromatographie auf SPE-Kartuschen
(NH₂, Accell™ Plus QMA, Accell Plus CM, SCX, SAX, WCX, WAX)

Kationen- und Anionenaustauscher werden je nach Art der Ionengruppe auf ihrer Oberfläche entweder als schwache oder starke Austauscher eingestuft. Starke Kationenaustauscher besitzen eine saure Oberflächeneinheit, wie z. B. eine Sulfonsäure, die über den gesamten pH-Bereich immer ionisiert [negativ geladen] ist. Schwache Kationenaustauscher haben eine saure Oberflächeneinheit, wie z. B. eine Carbonsäure, die bei hohem pH-Wert negativ geladen, aber bei niedrigem pH-Wert neutral ist. Ebenso tragen starke Anionenaustauscher typischerweise quaternäre Ammoniumgruppen, die immer positiv geladen sind, während schwache Anionenaustauscher primäre, sekundäre oder tertiäre Amingruppen besitzen, die bei niedrigen pH-Werten positiv, bei hohen pH-Werten jedoch neutral geladen sein können.

Verwenden Sie die folgende Tabelle als Leitfaden, um den geeigneten Kartuschentyp für SPE-Ionentauscher für Ihren speziellen Analyten auszuwählen.

Bei der Mixed-Mode-Ionenaustauschchromatographie wird die Verwendung von Umkehrphasen- und Ionenaustauschverfahren in einem einzigen Protokoll auf einer einzigen SPE-Kartusche kombiniert. Sie kann verwendet werden, um neutrale, saure und basische Verbindungen aus einer einzigen komplexen Matrix zu isolieren und zu trennen. Ein ideales Mixed-Mode-SPE-Sorbenssubstrat bleibt mit Wasser benetzbar und zeigt gleichzeitig eine starke Umkehrphasenretention von hydrophoben Verbindungen. Auf seiner Oberfläche befinden sich Ionenaustauscherfunktionen, die zu den vier oben beschriebenen allgemeinen Typen gehören. Zwischenwaschungen mit organischen Lösungsmittelgemischen geeigneter Elutionsstärke können verwendet werden, um neutrale Verbindungen [einschließlich ionisierbarer Analyten in ihrem neutralen Zustand] zu trennen. Eine selektive Elution von ionisch gebundenen Analyten kann durch Beeinflussung der Ladung entweder des Analyten [bei Bindung an starke Ionenaustauscher] oder des Sorbens [bei Analyten, die an schwache Ionenaustauscher gebunden sind] erreicht werden.