Leitfaden zu SPE
Ein leistungsstarkes Werkzeug für eine verbesserte Probenvorbereitung
Als Analytiker stehen Sie vor vielen Herausforderungen, wenn es darum geht, zu bestimmen, welche Tools Sie am besten einsetzen können, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen. Die Wahl der Probenvorbereitungstools und -methoden ist eine wichtige Überlegung, die sich erheblich auf Ihren Erfolg auswirken kann.
Im Idealfall wären Sie froh, wenn Sie keine Probenvorbereitung durchführen müssten. In der Praxis ist jedoch häufig eine Probenvorbereitung erforderlich. Möglicherweise müssen Sie eine Methode für eine vorhandene Probe optimieren, um den Durchsatz zu erhöhen oder die Kosten pro Analyse zu senken. Oder man bittet Sie, eine Vielzahl verschiedener Probentypen zu analysieren, um über neue Verbindungen von Interesse zu berichten. Jeder neue Probentyp kann unterschiedliche analytische Herausforderungen mit sich bringen. Darüber hinaus stehen die Wissenschaftler heute vor der großen Herausforderung, Werte in niedrigeren Konzentrationen als je zuvor zu melden, ohne dabei die Genauigkeit und Präzision zu beeinträchtigen.
Dieses Buch soll Ihnen helfen, ein sehr leistungsfähiges Tool für die Technologie der Probenvorbereitung zu entdecken und zu verstehen: die Festphasenextraktion [SPE]. Sie erfahren, wie diese Technologie, die Geräte mit chromatographischem Packungsmaterial verwendet, Ihnen dabei helfen kann, Ihre analytischen Herausforderungen zu meistern.
Definition der Festphasenextraktion
SPE ist eine Technologie zur Probenvorbereitung, bei der chromatographisches Packungsmaterial in Form von Feststoffpartikeln, das in der Regel in einem kartuschenartigen Gerät enthalten ist, verwendet wird, um die verschiedenen Bestandteile einer Probe chemisch zu trennen. Die Proben liegen fast immer im flüssigen Zustand vor [obwohl für einige Proben spezielle Applikationen in der Gasphase durchgeführt werden]. Abbildung 1 zeigt eine Probe, die schwarz erscheint. Diese wird mit einem SPE-Gerät so bearbeitet, dass die einzelnen Farbstoffverbindungen, aus denen die Probe besteht, chromatographisch getrennt werden.
Abbildung 1. Beispiele für eine SPE-Methode
Das Packungsbett kann dazu verwendet werden, die verschiedenen Verbindungen in einer Probe zu trennen, um die nachfolgenden analytischen Tests erfolgreicher durchzuführen. SPE wird zum Beispiel häufig zur selektiven Beseitigung von Störungen verwendet.
Die technisch korrekte Bezeichnung für diese Technologie ist Flüssig-Festphasenextraktion, da die chromatographischen Partikel fest sind und die Probe flüssig ist. Die gleichen chromatographischen Grundprinzipien der Flüssigchromatographie wie bei der HPLC werden auch hier verwendet, allerdings in einem anderen Format und aus einem anderen Grund. Hier wird die Chromatographie eingesetzt, um eine Probe besser vorzubereiten, bevor die Analyse durchgeführt wird.
Bei der Probenvorbereitung können Proben aus den unterschiedlichsten Quellen stammen. Dabei kann es sich um biologische Flüssigkeiten wie Plasma, Speichel oder Urin, um Umweltproben wie Wasser-, Luft- oder Bodenproben, um Lebensmittel wie Getreide, Fleisch und Meeresfrüchte, um Arzneimittel, Nutrazeutika, Getränke oder um Industrieprodukte handeln. Sogar die Köpfe von Mücken können als Probe verwendet werden! Für die Analyse von Neuropeptiden, die aus dem Gehirn von Moskitos extrahiert wurden, war SPE die Probenvorbereitungsmethode der Wahl [Waters Applikationsdatenbank, 1983].
Vier Hauptvorteile der SPE
Der Einsatz von SPE bietet viele Vorteile, aber vier Hauptvorteile verdienen besondere Aufmerksamkeit.
1. Vereinfachung einer komplexen Probenmatrix und Aufreinigung von Verbindungen
Eines der schwierigsten Probleme für einen Analytiker stellen interessierende Verbindungen in einer komplexen Probenmatrix dar, wie z. B. Mykotoxine in Getreide, Antibiotikarückstände in Garnelen oder Wirkstoffmetaboliten in Plasma, Serum oder Urin. Die große Anzahl von störenden Bestandteilen oder Substanzen in der Probenmatrix zusammen mit den interessierenden Verbindungen macht die Analyse extrem schwierig.
Das erste Problem, das es zu lösen gilt, ist die Komplexität der Analyse selbst, die sich aus dem Vorhandensein vieler Verbindungen ergibt, die getrennt werden müssen, um die interessierende(n) Verbindung(en) zu identifizieren und zu quantifizieren. Siehe Abbildung 2.
Abbildung 2. Beispiel für eine komplexe Probe
Die Robustheit des Assays ist möglicherweise nicht ausreichend, da jede geringfügige Änderung die Auflösung der Trennung eines kritischen Analytenpaares beeinträchtigen könnte.
Eine weitere Überlegung ist, dass das Vorhandensein aller Störungen in der ursprünglichen Probenmatrix zu Ausfallzeiten des Geräts führen kann, da sich bei jeder Injektion Verunreinigungen ansammeln. Würden die Störungen im Rahmen der Probenvorbereitung entfernt, könnten die interessierenden Verbindungen mit einer einfacheren, robusteren Methode analysiert werden. Dies ist in Abbildung 3 zu sehen, in der die ursprüngliche Probe (oben) mit der neuen mittels SPE aufbereiteten Probe (unten) verglichen wird.
Abbildung 3. Vergleich der Komplexität der Probenmatrix
Ein weiterer Vorteil der Vereinfachung der Probenmatrix ist die verbesserte Quantifizierungsgenauigkeit. Die obere blaue Kurve für Verbindung 1 in Abbildung 4 scheint zunächst akzeptabel zu sein. Sie weist jedoch tatsächlich eine gewisse Kontamination durch die Probenmatrix auf, wenn man sie mit der Kurve der reinen Probenmatrix in Rot vergleicht, die direkt darunter angezeigt wird. Bei einem geeigneten SPE-Protokoll zeigen die unteren Kurven dieselben Verbindungen ohne durch Störungen verursachte Probleme, was die Quantifizierung viel genauer macht.
Abbildung 4. Verbesserte Quantifizierung durch bessere Probenvorbereitung
Ein weiteres Beispiel ist in Abbildung 5 dargestellt. Die obere Kurve zeigt eine signifikante Störung durch die Probenmatrix bei den Verbindungen 1 und 2. Die untere Kurve zeigt aufgrund der korrekten Probenvorbereitung mit SPE stark verbesserte Ergebnisse [saubere Basislinie]. Beachten Sie, dass eine deutlich sauberere Basislinie die Genauigkeit der Analyseergebnisse verbessert. Außerdem kann ein viel reinerer Extrakt gewonnen werden, wenn die Probe eine Trennung und Aufreinigung dieser Verbindung erforderlich macht.
Abbildung 5. Signifikante Verbesserung der Basislinie mithilfe der SPE-Technologie
2. Verringern der Ionensuppression oder Ionenverstärkung für MS-Applikationen
Das zweite Problem bei komplexen Probenmatrizes wird bei der Betrachtung der Ausgabe des Massenspektrometers [LC-MS oder LC/MS/MS] deutlich. Für eine korrekte MS-Signalstärke [Empfindlichkeit] muss dem Ion der Verbindung ermöglicht werden, sich richtig zu bilden. In Fällen, in denen die Bildung des Ions der Verbindung durch Störungen in der Probenmatrix unterdrückt wird, wird die Signalstärke stark verringert.
Dieser Effekt wird in Abbildung 6 gezeigt. Der obere Ausgang ist das Signal für unsere interessierenden Verbindungen, wenn diese in eine Kochsalzlösung injiziert werden. Die untere Kurve zeigt eine signifikante Verringerung der Reaktion [> 90%ige Suppression] dieser gleichen Verbindungen, wenn sie in menschlichem Plasma analysiert wurden. Für die untere Kurve wurde lediglich ein gebräuchlicher Schritt der Proteinfällung durchgeführt. Bei dieser Technik werden die Matrixstörungen, die die Ionensuppression verursachen, nicht aufgereinigt, was zu einer schlechten Signalstärke führt.
Abbildung 6. Beispiel für Ionensuppression aufgrund der Probenmatrix
Ein weiteres gutes Beispiel für diesen Suppressionseffekt wird in Abbildung 7 gezeigt. In der oberen Kurve der MS-Ausgabe, bei der die Plasmaprobe nur mit einem Schritt der Proteinfällung vorbereitet wurde, ist der Terfenadin-Peak um 80 % unterdrückt. In der unteren Kurve, in der dieselbe Probe mit einer SPE-Methode hergestellt wurde, ist eine minimale Ionensuppression zu erkennen. Da die Störungen durch die Probenmatrix entfernt wurden, konnte sich das Ion der Verbindung ordnungsgemäß bilden, wodurch ein besseres Signal erzeugt wurde.
Abbildung 7. Verringerte Ionensuppression mit der richtigen SPE
In einigen Fällen können Störungen durch die Probenmatrix das ausgegebene Signal einer Verbindung künstlich verstärken. Dies wird als Ionenverstärkung bezeichnet und führt zu einem ungenau hohen ausgegebenen Wert. Eine korrekte SPE-Methode minimiert diesen Effekt, indem die Störungen aus der Verbindung entfernt werden, was zu einem genaueren ausgegebenen Wert führt.
3. Möglichkeit der Fraktionierung der Probenmatrix zur Analyse von Verbindungen nach Klasse
Ein Anwender kann mit einer Probe konfrontiert werden, die viele Verbindungen enthält, und muss diese nach Klassen trennen, damit die weitere Analyse viel effizienter durchgeführt werden kann. Ein Erfrischungsgetränk zum Beispiel enthält eine Vielzahl von Verbindungen in seiner Zusammensetzung. Es könnte eine SPE-Methode entwickelt werden, um die verschiedenen Verbindungsklassen, zum Beispiel nach ihrer Polarität, zu trennen. Die polaren Verbindungen könnten als separate Fraktion von den unpolareren Verbindungen gesammelt werden. Diese beiden Fraktionen könnten dann viel effizienter separat analysiert werden, da ihre Verbindungen ähnlicher wären.
Ein Beispiel für die Leistungsfähigkeit der Fraktionierung durch SPE ist in Abbildung 8 dargestellt. Hier wird eine komplexe Probe eines Trockenpulvers [lila Weintraubengetränk-Gemisch] auf einfache Weise in vier Fraktionen getrennt: eine Fraktion mit nur der polaren Verbindungen, eine aufgereinigte rote Verbindung, eine aufgereinigte blaue Verbindung und eine Fraktion, die alle verbleibenden, sehr unpolaren Verbindungen enthält. Sie werden an anderer Stelle in diesem Buch sehen, wie leistungsstark diese Fähigkeit sein kann.
Abbildung 8. Probenvorbereitung mittels SPE
Eine ausführlichere Beschreibung der Probenfraktionierung durch SPE finden Sie auf Seite 125 im Abschnitt „Methodenentwicklung“.
4. Spurenkonzentration [Anreicherung] sehr schwach konzentrierter Verbindungen
Anwender müssen heute oft über Verbindungen in weitaus niedrigeren Konzentrationen als je zuvor berichten, die bis zu Teilen pro Billion [ppt] und sogar noch niedriger reichen. In der Regel sind diese Werte in der reinen Probe niedriger als die Empfindlichkeit der Analysegeräte.
Ein gutes Beispiel dafür ist die Analyse auf Spuren von Verunreinigungen in Umweltproben oder die Entwicklung von Metaboliten in biologischen Flüssigkeiten im Laufe der Zeit. Die obere Kurve in Abbildung 9 zeigt das schlechte Signal der ursprünglichen reinen Probe für die interessierende Verbindung. Unter Verwendung derselben Analysebedingungen, aber mit der mit SPE aufbereiteten Probe in einer Spurenkonzentration, zeigt die untere Kurve einen dramatischen Anstieg der Signalstärke für diese Verbindung. Anhand dieses Ergebnisses lässt sich die ursprüngliche Konzentration der Verbindungen in der reinen Probe genau berechnen.
Abbildung 9. Beispiel für eine Spurenkonzentration
Ohne die Retentionsfähigkeit von chromatographischen Packungsmaterialien in der SPE wäre es mit anderen Methoden der Probenvorbereitung sehr schwierig, wenn nicht unmöglich, die Konzentration von (einer) bestimmten Verbindung(en) nachzuweisen.
Zusammenfassung
Wie wir gesehen haben, kann ein SPE-Gerät mit einem Packungsbett vier entscheidende Funktionen erfüllen, um die Analyse der Probe erfolgreicher zu gestalten. Siehe Abbildung 10.
Abbildung 10. Leistung durch SPE
Wir haben uns bemüht, in diesem Buch alle SPE-Grundlagen und Erfolgstechniken zu vermitteln, die von Wissenschaftlern aus aller Welt stammen, die in den letzten dreißig Jahren auf diese Technologie vertraut haben. Heutzutage ist die SPE bei der Lösung schwieriger Probenvorbereitungs- und Analyseprobleme nützlicher denn je.
Wir hoffen, dass dieses Buch Sie in die Lage versetzt, die Möglichkeiten der SPE zu verstehen und zu beherrschen, sodass auch Sie die Leistungsfähigkeit dieser Technologie in Ihrem Labor nutzen können.
