Leitfaden zur Flüssigchromatographie für Einsteiger

Die Komponenten eines grundlegenden Hochleistungs-Flüssigchromatographiesystems [HPLC] sind in dem einfachen Diagramm in Abbildung E dargestellt.

Ein Behälter enthält das Lösungsmittel [wegen seiner Bewegung mobile Phase genannt]. Eine Hochdruckpumpe [Lösungsmittelzuführungssystem oder Solvent Manager] wird verwendet, um eine festgelegte Flussrate der mobilen Phase zu erzeugen und zu dosieren, normalerweise in Milliliter pro Minute. Ein Injektor [Sample Manager oder Autosampler] kann die Probe in den kontinuierlich fließenden Strom der mobilen Phase einführen [injizieren], der die Probe in die HPLC-Säule befördert. Die Säule enthält das chromatographische Packungsmaterial, das für die Trennung benötigt wird. Dieses Packungsmaterial wird stationäre Phase genannt, da es von der Säulenhardware gehalten wird. Es wird ein Detektor benötigt, um die getrennten Verbindungsbanden zu sehen, wenn sie aus der HPLC-Säule eluieren [die meisten Verbindungen haben keine Farbe, sodass wir sie nicht mit den Augen sehen können]. Die mobile Phase verlässt den Detektor und kann wahlweise dem Abfall zugeführt oder gesammelt werden. Wenn die mobile Phase ein getrenntes Verbindungsband enthält, bietet die HPLC die Möglichkeit, diese Fraktion des Eluats, die diese gereinigte Verbindung enthält, für weitere Untersuchungen zu sammeln. Dies wird präparative Chromatographie genannt [wird im Abschnitt über den HPLC-Maßstab besprochen].

Beachten Sie, dass Hochdruckleitungen und -fittings verwendet werden, um die Komponenten von Pumpe, Injektor, Säule und Detektor miteinander zu verbinden, um die Leitung für die mobile Phase, die Probe und die getrennten Verbindungsbanden zu bilden.

Der Detektor ist mit der Datenstation des Computers verbunden, der HPLC-Systemkomponente, die das elektrische Signal aufzeichnet, das zur Erstellung des Chromatogramms auf dem Display und zur Identifizierung und Quantifizierung der Konzentration der Probenbestandteile erforderlich ist (siehe Abbildung F). Da die Eigenschaften der Probenverbindungen sehr unterschiedlich sein können, wurden verschiedene Detektortypen entwickelt. Wenn eine Verbindung zum Beispiel ultraviolettes Licht absorbieren kann, wird ein UV-Absorptionsdetektor verwendet. Wenn die Verbindung fluoresziert, wird ein Fluoreszenzdetektor verwendet. Weist die Verbindung keines dieser Merkmale auf, wird ein universellerer Detektortyp verwendet, wie z. B. ein Verdampfungs-Lichtstreudetektor [ELSD]. Der leistungsstärkste Ansatz ist die Verwendung mehrerer Detektoren in Reihe. So kann beispielsweise ein UV- und/oder ELSD-Detektor in Kombination mit einem Massenspektrometer [MS] verwendet werden, um die Ergebnisse der chromatographischen Trennung zu analysieren. Dadurch erhalten Sie aus einer einzigen Injektion umfassendere Informationen über einen Analyten. Die Kopplung eines Massenspektrometers mit einem HPLC-System wird als LC-MS bezeichnet.

HPLC-Betrieb

Das Diagramm in Abbildung G zeigt auf einfache Weise, wie wir die Trennung der in einer Probe enthaltenen Verbindungen erreichen.

Die mobile Phase tritt von links in die Säule ein, durchläuft das Partikelbett und verlässt die Säule auf der rechten Seite. Die Flussrichtung wird durch grüne Pfeile dargestellt. Betrachten Sie zunächst die obere Abbildung. Sie zeigt die Säule zum Zeitpunkt Null [dem Zeitpunkt der Injektion], wenn die Probe in die Säule eintritt und beginnt, ein Band zu bilden. Die hier gezeigte Probe, eine Mischung aus gelben, roten und blauen Farbstoffen, erscheint am Einlass der Säule als ein einzelnes schwarzes Band. [In Wirklichkeit könnte diese Probe alles sein, was sich in einem Lösungsmittel auflösen lässt; in der Regel wären die Verbindungen farblos und die Säulenwand undurchsichtig, sodass wir einen Detektor bräuchten, um die getrennten Verbindungen bei der Elution zu beobachten.]

Nach einigen Minuten [untere Abbildung], in denen die mobile Phase kontinuierlich und gleichmäßig an den Partikeln des Packungsmaterials vorbeiströmt, können wir sehen, dass sich die einzelnen Farbstoffe in getrennten Banden mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegt haben. Das liegt daran, dass die mobile Phase und die stationäre Phase um die Anziehung der einzelnen Farbstoffe oder Analyten konkurrieren. Beachten Sie, dass sich das gelbe Farbstoffband am schnellsten bewegt und im Begriff ist, die Säule zu verlassen. Der gelbe Farbstoff wird von der mobilen Phase stärker angezogen als die anderen Farbstoffe. Daher bewegt sie sich mit einer schnelleren Geschwindigkeit, die der der mobilen Phase näher kommt. Das blaue Farbstoffband wird stärker vom Packungsmaterial angezogen als von der mobilen Phase. Seine stärkere Anziehungskraft auf die Partikel führt dazu, dass es sich erheblich langsamer bewegt. Mit anderen Worten, es ist die am meisten zurückgehaltene Verbindung in dieser Probenmischung. Das rote Farbstoffband hat eine mittlere Anziehungskraft auf die mobile Phase und bewegt sich daher mit mittlerer Geschwindigkeit durch die Säule. Da sich jedes Farbstoffband mit unterschiedlicher Geschwindigkeit bewegt, können wir sie chromatographisch trennen.

Was ist ein Detektor?

Wenn die getrennten Farbstoffbanden die Säule verlassen, gelangen sie sofort in den Detektor. Der Detektor enthält eine Flusszelle, die jedes getrennte Verbindungsband vor dem Hintergrund der mobilen Phase erkennt [siehe Abbildung H]. [In der Praxis sind Lösungen vieler Verbindungen bei typischen analytischen HPLC-Konzentrationen farblos.] Ein geeigneter Detektor kann das Vorhandensein einer Verbindung erkennen und das entsprechende elektrische Signal an die Datenstation eines Computers senden. Je nach den Eigenschaften und Konzentrationen der Verbindungen, die getrennt und analysiert werden müssen, wird zwischen vielen verschiedenen Detektortypen ausgewählt.

Was ist ein Chromatogramm?

Ein Chromatogramm ist eine Darstellung der Trennung, die chemisch [chromatographisch] im HPLC-System stattgefunden hat. Auf der Zeitachse werden eine Reihe von Peaks aufgetragen, die von einer Basislinie aus ansteigen. Jeder Peak stellt das Detektorsignal für eine andere Verbindung dar. Das Chromatogramm wird von der Datenstation des Computers aufgezeichnet [siehe Abbildung H].

In Abbildung H hat das gelbe Band die Flusszelle des Detektors vollständig durchlaufen. Das erzeugte elektrische Signal wurde an die Datenstation des Computers gesendet. Das resultierende Chromatogramm wird nun auf dem Bildschirm angezeigt. Beachten Sie, dass das Chromatogramm mit der ersten Injektion der Probe beginnt und sich als gerade Linie am unteren Rand des Bildschirms abzeichnet. Dies wird als Basislinie bezeichnet. Sie stellt die reine mobile Phase dar, die die Flusszelle im Laufe der Zeit durchläuft. Wenn das gelbe Analytband die Flusszelle durchläuft, wird ein stärkeres Signal an den Computer gesendet. Die Linie verläuft zunächst nach oben und dann nach unten, und zwar proportional zur Konzentration des gelben Farbstoffs im Probenband. Dadurch entsteht im Chromatogramm ein Peak. Nachdem das gelbe Band die Detektorzelle vollständig verlassen hat, kehrt der Signalpegel zur Basislinie zurück; die Flusszelle enthält jetzt wieder nur die reine mobile Phase. Da sich die gelbe Bande am schnellsten bewegt und zuerst von der Säule eluiert, ist sie der erste Peak, der aufgezeichnet wird.

Wenig später erreicht das rote Band die Flusszelle. Das Signal steigt von der Basislinie an, wenn das rote Band zum ersten Mal in die Zelle eintritt, und der Peak, der das rote Band darstellt, beginnt, aufgezeichnet zu werden. In diesem Diagramm hat das rote Band die Flusszelle nicht vollständig durchlaufen. Das Diagramm zeigt, wie das rote Band und der rote Peak aussehen würden, wenn wir den Prozess zu diesem Zeitpunkt anhalten würden. Da der Großteil des roten Bands die Zelle durchlaufen hat, wurde der größte Teil des Peaks aufgezeichnet, wie durch die durchgezogene Linie dargestellt. Wenn wir neu starten könnten, würde das rote Band die Flusszelle vollständig passieren und der rote Peak würde vervollständigt werden [gepunktete Linie]. Das blaue Band, das am stärksten zurückgehalten wird, bewegt sich am langsamsten und eluiert nach dem roten Band. Die gepunktete Linie zeigt Ihnen, wie das fertige Chromatogramm aussehen würde, wenn wir den Lauf bis zum Ende fortgesetzt hätten. Interessanterweise ist der blaue Peak am breitesten, da das blaue Analytband, während es auf der Säule am schmalsten ist, am breitesten wird, wenn es von der Säule eluiert. Dies liegt daran, dass es sich langsamer durch das chromatographische Packungsmaterial bewegt und mehr Zeit [und das Volumen der mobilen Phase] benötigt, um vollständig zu eluieren. Da die mobile Phase kontinuierlich mit einer festen Geschwindigkeit fließt, verbreitert sich das blaue Band und ist stärker verdünnt. Da der Detektor proportional zur Bandenkonzentration reagiert, ist der blaue Peak niedriger, dafür aber breiter.