Leitfaden für Einsteiger zur Flüssigchromatographie

Alumina

Eine poröse, partikelförmige Form von Aluminiumoxid [Al₂0₃], die als stationäre Phase in der Normalphasen-Adsorptionschromatographie verwendet wird. Aluminiumoxid hat eine hochaktive basische Oberfläche; der pH-Wert einer 10%igen wässrigen Aufschlämmung beträgt etwa 10. Es wird nacheinander mit starker Säure gewaschen, um neutrale und saure Qualitäten herzustellen [Aufschlämmung pH 7,5 bzw. 4]. Aluminiumoxid ist hygroskopischer als Silika. Seine Aktivität wird nach der Brockmann†-Skala für den Wassergehalt gemessen; z. B. enthält Aktivitätsgrad I 1 % H₂O.

†H. Brockmann und H. Schodder, Ber. 74: 73 (1941)

Basislinie*

Der Teil des Chromatogramms, der das Detektorsignal aufzeichnet, wenn nur die mobile Phase aus der Säule austritt.

Kartusche

Ein Säulentyp ohne Fittings, der einfach aus einem offenen Röhrchen besteht, wobei das Packungsmaterial an beiden Enden von je einer Fritte zurückgehalten wird. SPE-Kartuschen können parallel an einer Vakuumstation betrieben werden. HPLC-Kartuschen werden in einen Kartuschenhalter platziert, der an beiden Enden Flüssigkeitsverbindungen aufweist. Kartuschensäulen sind einfach auszuwechseln, weniger kostspielig und praktischer als herkömmliche Säulen mit integrierten Fittings.

Chromatogramm*

Eine grafische oder andere Darstellung des Detektorsignals oder einer anderen Größe, die als Maß für die Konzentration des Analyten im Ablauf gegen das Ablaufvolumen oder die Zeit verwendet wird. Bei der Planarchromatographie [z. B. Dünnschichtchromatographie oder Papierchromatographie] kann sich das Chromatogramm auf das Papier oder die Schicht beziehen, die die getrennten Zonen enthält.

Chromatographie*

Eine dynamische physikalisch-chemische Trennmethode, bei der die zu trennenden Komponenten auf zwei Phasen verteilt werden, von denen eine stationär ist [die stationäre Phase], während sich die andere [die mobile Phase] relativ zur stationären Phase bewegt.

Säulenvolumen* [Vc]

Das geometrische Volumen des Teils des Röhrchens, der die Packung enthält [innere Querschnittsfläche des Röhrchens multipliziert mit der Länge der Packung, L]. Das interpartikuläre Volumen der Säule, auch Hohlvolumen genannt, ist das Volumen, das von der mobilen Phase zwischen den Partikeln im Füllbett eingenommen wird. Das Totvolumen [V₀] ist das Gesamtvolumen, das von der mobilen Phase eingenommen wird, d. h. die Summe des Hohlvolumens und des Intrapartikelvolumens [auch Porenvolumen genannt].

Detektor* [siehe Empfindlichkeit]

Ein Gerät, das eine Änderung der Zusammensetzung des Eluenten durch Messung physikalischer oder chemischer Eigenschaften anzeigt [z. B. Absorption im UV-/sichtbaren Licht, unterschiedlicher Brechungsindex, Fluoreszenz oder Leitfähigkeit]. Wenn das Signal des Detektors linear zur Probenkonzentration ist, kann die Menge einer Komponente durch eine geeignete Kalibrierung mit Standards quantifiziert werden. Häufig kann es vorteilhaft sein, zwei verschiedene Detektortypen in Reihe zu verwenden. Auf diese Weise können weitere bestätigende oder spezifische Informationen über die Probenanalyten erhalten werden. Einige Detektoren [z. B. elektrochemisch, massenspektrometrisch] wirken zerstörend; d. h. sie bewirken eine chemische Änderung der Probenkomponenten. Wenn ein solcher Detektor mit einem zerstörungsfreien Detektor kombiniert wird, wird er normalerweise an zweiter Stelle im Flussweg platziert.

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Ein Gerät, das die elektrische Reaktion eines Detektors in Form eines Chromatogramms auf einem Computerbildschirm aufzeichnet. Fortschrittliche Datenaufzeichnungssysteme führen außerdem Berechnungen mithilfe ausgeklügelter Algorithmen durch, um z. B. Peakflächen zu integrieren, Basislinien zu subtrahieren, Spektren zuzuordnen, Komponenten zu quantifizieren und Unbekannte durch Vergleich mit Standardbibliotheken zu identifizieren.

Effizienz [H, siehe Trennstufenzahl, Auflösung, Empfindlichkeit, Geschwindigkeit]

Ein Maß für die Fähigkeit einer Säule, der Dispersion einer Probenbande beim Passieren der Säule zu widerstehen. Eine effiziente Säule minimiert die Bandendispersion bzw. Bandenverbreiterung. Eine höhere Effizienz ist für eine effektive Trennung, höhere Empfindlichkeit und/oder Identifizierung ähnlicher Komponenten in einem komplexen Probengemisch wichtig.

Die Nobelpreisträger Martin und Synge führten in Analogie zur Destillation das Konzept der Plattenhöhe [H oder H.E.T.P., Höhe entsprechend einer theoretischen Platte] als Maß für die chromatographische Effizienz und zum Vergleich der Säulenleistung ein.† Durch den Einsatz der HPLC- und UPLC-Technologie wurde erkannt, dass ein homogenes Bett mit der kleinstmöglichen Partikelgröße [die einen höheren Druck erforderte] der Schlüssel zur maximalen Effizienz ist. Die Beziehung zwischen den Parametern der Säule und des Trennsystems, die die Bandenverbreiterung beeinflussen, wurde später von van Deemter in einer Gleichung beschrieben.††

Chromatographen nennen die Effizienz häufig eine Größe, die sie einfach und direkt aus Messungen eines Chromatogramms berechnen können, nämlich die Trennstufenzahl [N]. Die Trennstufenhöhe wird dann aus dem Verhältnis der Länge des Säulenbetts zu N bestimmt [H = L/N; Methoden zur Berechnung von N aus einem Chromatogramm sind in Abbildung U gezeigt]. Es ist wichtig zu beachten, dass die Berechnung von N oder H mit diesen Methoden nur unter isokratischen Bedingungen korrekt ist und nicht für Gradiententrennungen verwendet werden kann.

†A.J.P. Martin and R.M. Synge, Biochem. J. 35: 1358–1368 [1941]
††J.J. van Deemter, F. J. Zuiderweg und A. Klinkenberg, Chem. Eng. Sci. 5: 271–289 [1956]

Eluat

Der Anteil des Eluenten, der aus dem Säulenauslass austritt, der Analyten in Lösung enthält. Bei der analytischen HPLC wird das Eluat vom Detektor auf die Konzentration oder Masse der darin enthaltenen Analyten untersucht. Bei der präparativen HPLC wird das Eluat kontinuierlich in Aliquote zu gleichförmigen Zeit- oder Volumenintervallen oder diskontinuierlich nur dann gesammelt, wenn ein Detektor das Vorhandensein eines interessierenden Peaks anzeigt. Diese Fraktionen werden anschließend verarbeitet, um gereinigte Verbindungen zu erhalten.

Eluent

Die mobile Phase [siehe Elutionschromatographie]

Eluotrope Reihe

Eine Liste von Lösungsmitteln, geordnet nach Elutionsstärke, in Bezug auf angegebene Analyten auf einem Standardsorbens. Eine solche Reihe ist nützlich, wenn sowohl isokratische als auch Gradientenelutionsmethoden entwickelt werden. Trappe prägte diesen Begriff, nachdem er gezeigt hatte, dass eine Abfolge von Lösungsmitteln mit zunehmender Polarität die Lipidfraktionen auf Aluminiumoxid trennen kann.† Später bestimmte Snyder die Parameter der Lösungsmittelstärke für eine große Liste von Lösungsmitteln an mehreren Normalphasen-LC-Sorbenzien und stellte diese in Tabellen auf.†† Neher hat ein sehr nützliches Nomogramm erstellt, mit dem äqui-eluotrope [konstante Elutionsstärke] Gemische von Normalphasen-Lösungsmitteln ausgewählt werden können, um die Selektivität von TLC-Trennungen zu optimieren.†††

Eine typische eluotrope Reihe der Normalphase würde am schwachen Ende mit unpolaren aliphatischen Kohlenwasserstoffen beginnen, z. B. Pentan oder Hexan, und dann sukzessiv zu Benzol [einem aromatischen Kohlenwasserstoff], Dichlormethan [einem Chlorkohlenwasserstoff], Diethylether, Ethylacetat [einem Ester], Aceton [einem Keton] und schließlich Methanol [einem Alkohol] am starken Ende übergehen [siehe Abbildung R-1].

†W. Trappe, Biochem. Z. 305: 150 [1940]
††L. R. Snyder, Principles of Adsorption Chromatography, Marcel Dekker [1968], S. 192 – 197
†††R. Neher in G.B. Marini-Bettòlo, ed., Thin-Layer Chromatography, Elsevier [1964] S. 75 – 86

Eluieren* [Verb]

Zur Chromatographie durch Elutionschromatographie. Der Elutionsvorgang kann angehalten werden, während sich alle Probenkomponenten noch auf dem Chromatographiebett befinden [planare Dünnschicht- oder Papierchromatographie], oder kann so lange fortgesetzt werden, bis die Komponenten das Chromatographiebett verlassen haben [Säulenchromatographie].

Hinweis: Der Begriff Eluieren wird bevorzugt entwickelt [ein Begriff aus der Planarchromatographie], um Verwirrung mit der Praxis der Methodenentwicklung zu vermeiden, bei der ein Separations-/Trennsystem [die Kombination mobiler und stationärer Phasen] für eine bestimmte Trennung optimiert wird.

Elutionschromatographie*

Ein Verfahren zur chromatographischen Trennung, bei dem die mobile Phase kontinuierlich durch das Chromatographiebett geleitet wird. Sobald sich die Basislinie des Detektors stabilisiert und das Trennsystem ein Gleichgewicht erreicht hat, wird bei der HPLC eine begrenzte Menge der Probe in den fließenden Strom der mobilen Phase gegeben. Die Elution wird fortgesetzt, bis alle relevanten Analyten den Detektor durchlaufen haben.

Elutionsstärke

Ein Maß für die Affinität eines Lösungsmittels in Bezug auf die Affinität des Analyten für die stationäre Phase. Ein schwaches Lösungsmittel kann den Analyten nicht verdrängen, sodass er stark an der stationären Phase zurückgehalten wird. Ein starkes Lösungsmittel kann alle Analytmoleküle vollständig verdrängen und durch die Säule transportieren, ohne sie zurückzuhalten. Um ein Gleichgewicht zwischen effektiver Trennung und angemessenem Elutionsvolumen zu erreichen, werden Lösungsmittel oft gemischt, um eine angemessene Konkurrenz zwischen den Phasen herzustellen und dadurch sowohl die Selektivität als auch die Trennzeit für einen gegebenen Satz von Analyten zu optimieren [siehe Selektivität].

Dipolmoment, Dielektrizitätskonstante, Wasserstoffbrückenbindungen, Molekülgröße und -form sowie Oberflächenspannung können Hinweise auf die Elutionsstärke geben. Die Elutionsstärke wird auch durch den Trennmodus bestimmt. Eine eluotrope Reihe von Lösungsmitteln kann unter Adsorptions- oder Normalphasenbedingungen durch eine zunehmende Stärke in einer Richtung geordnet sein; diese Ordnung kann unter Umkehrphasen-Verteilungsbedingungen nahezu entgegengesetzt sein [siehe Abbildung R-1].

Fluoreszenzdetektor

Fluoreszenzdetektoren regen eine Probe mit einer bestimmten Wellenlänge des Lichts an. Dies führt dazu, dass bestimmte Verbindungen fluoreszieren und Licht mit einer höheren Wellenlänge emittieren. Ein Sensor, der auf eine bestimmte Emissionswellenlänge eingestellt und so abgedeckt ist, dass er von der Anregungsquelle nicht geblendet wird, sammelt nur das emittierte Licht. Häufig werden Analyten, die nicht fluoreszieren, derivatisiert, um die hohe Empfindlichkeit und Selektivität dieser Form der Detektion zu nutzen, z. B. die AccQ•Tag-Derivatisierung von Aminosäuren.

Flussrate*

Das Volumen der mobilen Phase, das in einer Zeiteinheit durch die Säule fließt. In HPLC-Systemen wird die Flussrate durch die Steuerung für das Lösungsmittelzuführungssystem [Pumpe] eingestellt. Die Genauigkeit der Flussrate kann durch zeitgesteuertes Sammeln und Messen des Ablaufs am Säulenauslass überprüft werden. Da die Dichte eines Lösungsmittels mit der Temperatur variiert, muss diese Variable bei jeder Kalibrierung oder Flussratenmessung berücksichtigt werden. Die genauesten Bestimmungen werden, wenn möglich, nach Gewicht, nicht nach Volumen, durchgeführt.

Die Gleichmäßigkeit [Präzision] und Reproduzierbarkeit der Flussrate ist für viele LC-Techniken wichtig, insbesondere bei Trennungen, bei denen Retentionszeiten der Schlüssel zur Analytidentifizierung sind, oder bei der Gelpermeationschromatographie, bei der Kalibrierung und Korrelation der Retentionszeiten für genaue Messungen der Molekulargewichtsverteilung in Polymeren entscheidend sind.

Trennbedingungen werden häufig anhand der linearen Geschwindigkeit verglichen, nicht anhand der Flussrate. Die lineare Geschwindigkeit wird berechnet, indem die Flussrate durch die Querschnittsfläche der Säule geteilt wird. Während die Flussrate in Volumen/Zeit [z. B. mL/min] ausgedrückt wird, wird die lineare Geschwindigkeit in Länge/Zeit [z. B. mm/s] gemessen.

Gelpermeationschromatographie*

Die Trennung basiert hauptsächlich auf Ausschlusseffekten aufgrund von Unterschieden in der Molekülgröße und/oder -form. Gelpermeationschromatographie und Gelfiltrationschromatographie beschreiben den Prozess, wenn die stationäre Phase ein gequollenes Gel ist. Beides sind Formen der Größenausschlusschromatographie. Porath und Flodin beschrieben erstmals die Gelfiltration mit Dextran-Gelen und wässrigen mobilen Phasen zur größenbasierten Trennung von Biomolekülen.† Moore wandte ähnliche Prinzipien zur Trennung organischer Polymere nach Größe in Lösung an, wobei mobile Phasen aus organischen Lösungsmitteln auf porösen Polystyrol-Divinylbenzol-Polymergelen verwendet wurden.††

†J. Porath, P. Flodin, Nature 183: 1657–1659 [1959]
††J.C. Moore, U.S. Patent 3,326,875 [eingereicht Jan. 1963; ausgegeben im Juni 1967]

Gradienten

Die zeitliche Änderung der relativen Konzentrationen von zwei [oder mehr] mischbaren Lösungsmittelkomponenten, die eine mobile Phase mit zunehmender Elutionsstärke bilden. Bei der Festphasenextraktion wird normalerweise ein Stufengradient verwendet; bei jedem Schritt ändert sich die Zusammensetzung des Eluenten abrupt von einer schwächeren mobilen Phase zu einer stärkeren mobilen Phase. Es ist sogar möglich, durch Trocknen des SPE-Sorbensbetts zwischen den Schritten von einem Lösungsmittel zu einem anderen nicht mischbaren Lösungsmittel zu wechseln.

Ein kontinuierlicher Gradient wird normalerweise durch ein Nieder- oder Hochdruckmischsystem [siehe Abbildungen J-2 und J-3] gemäß einer vordefinierten Kurve [linear oder nicht linear] erzeugt, die die Konzentration des stärkeren Lösungsmittels B im anfänglichen Lösungsmittel A über einen festgelegten Zeitraum darstellt. Ein Halten bei einer festen isokratischen Lösungsmittelzusammensetzung kann zu jedem Zeitpunkt innerhalb eines kontinuierlichen Gradienten programmiert werden. Am Ende einer Trennung kann das Gradientenprogramm auch so eingestellt werden, dass es zur ursprünglichen Zusammensetzung der mobilen Phase zurückkehrt, um die Säule als Vorbereitung für die Injektion der nächsten Probe erneut zu äquilibrieren. Hochentwickelte HPLC-Systeme können vier oder mehr Lösungsmittel [oder Lösungsmittelgemische] zu einem kontinuierlichen Gradienten mischen.

Injektor [Autosampler, Sample Manager]

Ein Mechanismus zum genauen und präzisen Einführen [Injizieren] eines diskreten, vorherbestimmten Volumens einer Probenlösung in den fließenden Strom der mobilen Phase. Der Injektor kann ein einfaches manuelles Gerät oder ein hochentwickelter Autosampler sein, der für die unbeaufsichtigte Injektion vieler Proben aus einer Reihe von einzelnen Vials oder Wells in einer vorgegebenen Reihenfolge programmiert werden kann. Die Probenräume in diesen Systemen können sogar temperaturgeregelt sein, um die Integrität der Probe über viele Betriebsstunden zu erhalten.

Die meisten modernen Injektoren enthalten eine Probenschleife, die mit einer Spritze gefüllt wird und mithilfe eines Multiportventils on- oder offline geschaltet werden kann. Ein gut konzipiertes Injektionssystem mit minimalem internem Volumen befindet sich so nah wie möglich am Säuleneinlass und minimiert die Bandenverbreiterung der Probe. Zwischen den Probeninjektionen kann sie auch mit einer mobilen Phase oder einem Waschlösungsmittel gespült werden, um eine Verschleppung [Kontamination der vorliegenden Probe durch eine frühere] zu verhindern.

Proben werden für die Injektion am besten vorbereitet, indem man sie in der mobilen Phase löst, in die sie injiziert werden; dies kann Probleme bei der Trennung bzw. Erkennung verhindern. Wenn ein anderes Lösungsmittel verwendet werden muss, ist es wünschenswert, dass seine Elutionsstärke gleich oder geringer als die der mobilen Phase ist. Es ist oft ratsam, ein wenig der Probenlösung offline mit der mobilen Phase zu mischen, um Ausfällungen oder Probleme mit der Mischbarkeit zu testen, die eine erfolgreiche Trennung beeinträchtigen könnten.

Einlass

Das Ende des Säulenbetts, an dem der Strom der mobilen Phase und die Probe eintreten. Eine poröse, inerte Fritte hält das Packungsmaterial zurück und schützt den Einlass des Sorbensbetts vor Verunreinigungen durch Partikel. Die gute HPLC-Praxis schreibt vor, dass Proben und mobile Phasen frei von Partikeln sein müssen; dies ist bei Säulen mit kleinen Partikeln unerlässlich, deren Einlässe viel schneller verstopfen. Wenn der Einlass des Säulenbetts verstopft ist und ein überdurchschnittlich hoher Gegendruck auftritt, kann manchmal eine Umkehrung der Fließrichtung, während der Ablauf in den Abfall geleitet wird, die auf der Fritte befindlichen Probenreste lösen und herausspülen. Wenn die Ablagerungen in die Fritte eingedrungen sind und sich am Einlassende des Betts absetzen, hat die Säule höchstwahrscheinlich das Ende ihrer Nutzungsdauer erreicht.

Ionenaustauschchromatographie* [siehe Abschnitt: Ladungstrennungen]

Dieser Trennmodus basiert hauptsächlich auf den Unterschieden in den Ionenaustauschaffinitäten der Probenkomponenten. Die Trennung von hauptsächlich anorganischen Ionen in Wasser oder gepufferten wässrigen mobilen Phasen an oberflächlich porösen Ionenaustauschersäulen mit kleinen Partikeln gefolgt von einer konduktometrischen oder elektrochemischen Detektion wird als Ionenchromatographie [IC] bezeichnet.

Isokratische Elution*

Ein Verfahren, bei dem die Zusammensetzung der mobilen Phase während der Elution konstant bleibt.

Flüssigchromatographie* (LC)

Eine Trenntechnik, bei der die mobile Phase flüssig ist. Die Flüssigchromatographie kann in einer Säule oder in einer Ebene durchgeführt werden [TLC- oder Papierchromatographie]. Die moderne Flüssigchromatographie, die mit kleineren Partikeln und einem höheren Einlassdruck arbeitet, wurde 1970 als Hochleistungs- (oder Hochdruck-) Flüssigchromatographie [HPLC] bezeichnet. Im Jahr 2004 hat die Ultra-Performance-Flüssigchromatographie die Leistung der LC drastisch auf ein neues Niveau gehoben [siehe UPLC-Technologie].

Mobile Phase* [siehe Eluat, Eluent]

Eine Flüssigkeit, die in einer bestimmten Richtung durch das Sorbensbett der stationären Phase sickert. Die mobile Phase kann eine Flüssigkeit [Flüssigchromatographie], ein Gas [Gaschromatographie] oder ein superkritisches Fluid [Chromatographie mit superkritischem Fluid] sein. Bei der Gaschromatographie kann für die mobile Phase der Begriff Trägergas verwendet werden. In der Elutionschromatographie kann die mobile Phase auch als Eluent bezeichnet werden, während das Wort Eluat als der Teil der mobilen Phase definiert ist, der das Sorbensbett durchlaufen hat und die interessierenden Verbindungen in Lösung enthält.

Normalphasenchromatographie*

Ein Elutionsverfahren, bei dem die stationäre Phase polarer ist als die mobile Phase. Dieser Begriff wird in der Flüssigchromatographie verwendet, um den Unterschied zur Umkehrphasenchromatographie zu betonen.

Peak* [siehe Plattenzahl]

Der Teil eines Differenzialchromatogramms, der das Detektorsignal aufzeichnet, während eine einzelne Komponente von der Säule eluiert wird. Wenn die Trennung unvollständig ist, können zwei oder mehr Komponenten als ein Peak anstelle von zwei Peaks eluiert werden. Peaks, die unter optimalen Bedingungen von einer gut gepackten, effizienten Säule eluiert werden, die in einem System betrieben wird, das die Bandenverbreiterung minimiert, nähern sich der Form einer Gauß-Verteilung. Die Quantifizierung erfolgt normalerweise durch Messen der Peakfläche [eingeschlossen von der Basislinie und der Peakkurve]. Seltener kann die Peakhöhe [der Abstand vom Peakscheitel zur Basislinie] zur Quantifizierung verwendet werden. Dieses Verfahren erfordert, dass Peakbreite sowie Peakform konstant bleiben.

Trennstufenzahl* [N, siehe Effizienz]

Eine Zahl, die die Säulenleistung angibt [mechanische Trennleistung oder -effizienz, auch Trennstufenzahl genannt, Anzahl der theoretischen Trennstufen oder theoretische Trennstufenzahl]. Sie setzt die Höhe der Retention eines Peaks in Beziehung zu seiner Breite [Varianz oder Bandenbreite]. Zur Berechnung der Trennstufenzahl wird davon ausgegangen, dass ein Peak durch eine Gauß-Verteilung [eine statistische Glockenkurve] dargestellt werden kann. An den Wendepunkten [60,7 % der Peakhöhe] beträgt die Breite einer Gauß-Kurve das Doppelte der Standardabweichung [σ] um ihren Mittelwert [am Scheitelpunkt]. Wie in Abbildung U gezeigt, kann die Peakbreite einer Gauß-Kurve, die bei anderen Anteilen der Peakhöhe gemessen wird, in genau definierten Vielfachen von σ ausgedrückt werden. Peakretention [Retentionsvolumen, V_R oder Retentionszeit, t_R] und Peakbreite müssen in denselben Einheiten ausgedrückt werden, da N eine dimensionslose Zahl ist. Beachten Sie, dass die 5-Sigma-Methode zur Berechnung von N ein strengeres Maß für die Säulenhomogenität und Leistung ist, da sie durch Peakasymmetrien stärker beeinträchtigt wird. Computerdatenstationen können jeden aufgelösten Peak automatisch abgrenzen und die entsprechende Trennstufenzahl berechnen.

Präparative Chromatographie

Der Prozess der Verwendung von Flüssigchromatographie zur Isolierung einer Verbindung in einer Menge und einem Reinheitsgrad, die für weitere Experimente oder Applikationen ausreichen. Für pharmazeutische oder biotechnologische Reinigungsverfahren können Säulen mit einem Durchmesser von mehreren Fuß für mehrere Kilogramm Material verwendet werden. Um nur wenige Mikrogramm eines wertvollen Naturstoffs zu isolieren, reicht eine analytische HPLC-Säule aus. Beides sind präparative chromatographische Ansätze, die sich nur im Maßstab unterscheiden [siehe Abschnitt HPLC-Maßstab und Tabelle A].

Auflösung* [Rs, siehe Selektivität]

Die Trennung zweier Peaks ist das Ergebnis aus der Differenz ihrer zugehörigen Retentionszeiten, geteilt durch ihre durchschnittliche Peakbreite auf der Basislinie. R_s = 1,25 gibt an, dass zwei Peaks gleicher Breite gerade an der Basislinie getrennt sind. Bei R_s = 0,6 ist der einzige visuelle Hinweis auf das Vorhandensein von zwei Peaks in einem Chromatogramm eine kleine Kerbe in der Nähe des Peakscheitelpunkts. Säulen mit höherer Effizienz erzeugen schmalere Peaks und verbessern die Auflösung bei schwierigen Trennungen; die Auflösung wird jedoch nur um die Quadratwurzel von N erhöht. Die leistungsstärkste Methode zur Erhöhung der Auflösung ist die Erhöhung der Selektivität durch Änderung der Kombination aus mobiler und stationärer Phase, die für die chromatographische Trennung verwendet wird [siehe Abschnitt zu chemischem Trennvermögen].

Retentionsfaktor* [k]

Ein Maß für die Verweilzeit der Probenkomponente in der stationären Phase im Verhältnis zur Verweilzeit in der mobilen Phase; es drückt aus, wie viel länger eine Probenkomponente durch die stationäre Phase verzögert wird, als es dauern würde, um mit der Geschwindigkeit der mobilen Phase die Säule zu durchlaufen. Rechnerisch ist es das Verhältnis der angepassten Retentionszeit [Volumen] und der Überbrückungszeit [Volumen]: k = t_R'/t_M [siehe Retentionszeit und Selektivität].

Anmerkung: In der Vergangenheit wurde dieser Begriff auch als Partitionsverhältnis, Kapazitätsverhältnis, Kapazitätsfaktor oder Massenverteilungsverhältnis ausgedrückt und durch k' symbolisiert.

Retentionszeit* [tR]

Die Zeit zwischen dem Start der Elution [bei der HPLC typischerweise dem Zeitpunkt der Injektion oder Probeneinführung] und dem Auftreten des Peakmaximums. Die angepasste Retentionszeit, t_R', wird berechnet, indem von t_R die Überbrückungszeit [t_M, die Zeit von der Injektion bis zur Elution des Peakmaximums eines vollständig nicht zurückgehaltenen Analyten] abgezogen wird.

Umkehrphasenchromatographie*

Ein Elutionsverfahren aus der Flüssigchromatographie, bei dem die mobile Phase deutlich polarer ist als die stationäre Phase, z. B. ein mikroporöses Material auf Silikabasis, an dessen zugängliche Oberfläche Alkylketten chemisch gebunden sind. Hinweis: Vermeiden Sie den falschen Begriff Umkehrphase. [Siehe Referenz 4 für einige neue Ideen zum Mechanismus der Umkehrphasentrennungen.]

Selektivität [Trennfaktor, σ]

Ein Begriff, der verwendet wird, um die Größe der Differenz zwischen den relativen thermodynamischen Affinitäten eines Analytpaares für die angegebene mobile und stationäre Phase zu beschreiben, aus denen das Separations-/Trennsystem besteht. Der korrekte Begriff ist Trennfaktor [σ]. Er entspricht dem Verhältnis der Retentionsfaktoren, k2/k1 [siehe Retentionsfaktor]; per Definition ist σ immer ≥ 1. Wenn σ = 1, dann eluieren beide Peaks und es wird keine Trennung erreicht. In der präparativen Chromatographie ist es wichtig, α für höchste Probenbeladbarkeit und hohen Durchsatz zu maximieren. [siehe Abschnitt über chemische Trennleistung]

Empfindlichkeit* [S]

Die Signalausgabe pro Konzentrations- oder Masseneinheit einer Substanz in der mobilen Phase, die in den Detektor eintritt, z. B. die Steigung einer linearen Kalibrierkurve [siehe Detektor]. Bei konzentrationsempfindlichen Detektoren [z. B. UV/VIS-Absorption] ist die Empfindlichkeit das Verhältnis der Peakhöhe zur Analytkonzentration im Peak. Bei massendurchflussempfindlichen Detektoren ist dies das Verhältnis von Peakhöhe zu Masseneinheit. Wenn die Empfindlichkeit ein einzigartiges Leistungsmerkmal sein soll, darf sie nur vom chemischen Messverfahren abhängen, nicht von Skalierungsfaktoren.

Die Fähigkeit, einen Analyten nachzuweisen [zu qualifizieren] oder zu messen [zu quantifizieren], wird durch viele instrumentelle und chemische Faktoren bestimmt. Gut aufgelöste Peaks [maximale Selektivität], die von hocheffizienten Säulen eluiert werden [schmale Peakbreite mit guter Symmetrie für maximale Peakhöhe], sowie gute Detektorempfindlichkeit und Spezifität sind ideal. Sowohl die Interferenz des Trennsystems als auch das Rauschen der elektronischen Komponenten sollten minimiert werden, um eine maximale Empfindlichkeit zu erreichen.

Festphasenextraktion [SPE]

Eine Probenvorbereitungstechnik, die LC-Prinzipien verwendet, um Analyten aus einer komplexen Matrix zu isolieren, anzureichern und/oder zu reinigen, die auf ein chromatographisches Miniaturbett angewendet wird. Offline-SPE wird [manuell oder automatisiert] mit größeren Partikeln in einzelnen Kunststoffkartuschen oder in Mikroelutionsplatten-Wells durchgeführt, wobei ein niedriger positiver Druck oder ein Vakuum zur Unterstützung des Flusses verwendet werden. Online-SPE wird mit kleineren Partikeln in Miniatur-HPLC-Säulen durchgeführt, wobei höhere Drücke und ein Ventil verwendet werden, um die SPE-Säule online mit der primären HPLC-Säule oder offline zum Abfall zu schalten.

SPE-Methoden verwenden Stufengradienten [siehe Gradient], um die Schritte Bettkonditionierung, Probenladung, Waschen und Elution durchzuführen. Proben werden in der Regel unter Bedingungen geladen, bei denen das k wichtiger Analyten so hoch wie möglich ist, damit sie während der Lade- und Waschschritte vollständig zurückgehalten werden. Die Elution erfolgt durch Wechsel zu einem viel stärkeren Lösungsmittelgemisch [siehe Elutionsstärke]. Ziel ist es, Matrixstörungen zu beseitigen und den Analyten in einer für die nachfolgende Analyse geeigneten Lösung zu isolieren.

Geschwindigkeit [siehe Effizienz, Flussrate, Auflösung]

Ein Vorteil des Betriebs von LC-Trennungen bei höheren Lineargeschwindigkeiten unter Verwendung von analytischen Trennsäulen mit kleinerem Volumen und größeren Volumina und präparativen Säulen mit größeren Partikeln. Verbesserungen in der Größenordnung der LC-Geschwindigkeit kamen 1972 [unter Verwendung von 10-μm-Partikeln und Pumpen, die einen genauen Fluss der mobilen Phase bei 6000 psi liefern], 1976 [mit präparativen 75-μm-Säulen, die bei einer Flussrate von 500 mL/min betrieben werden] und im Jahr 2004 [mit der Einführung der UPLC-Technologie – Säulen mit 1,7-μm-Partikeln, betrieben bei 15000 psi].†

Analytische Hochgeschwindigkeits-LC-Systeme müssen nicht nur höheren Drücken im gesamten Flüssigkeitssystem standhalten; die Zykluszeit des Injektors muss kurz sein; Gradientenmischer müssen zu einem schnellen Wechsel zwischen den Proben fähig sein; Detektorsensoren müssen schnell auf kleinste Änderungen der Eluatzusammensetzung reagieren; und Datensysteme müssen jede Sekunde dutzende von Punkten sammeln, die erforderlich sind, um schmale Peaks genau darzustellen und zu quantifizieren.

Höhere Auflösung, höhere Geschwindigkeit und höhere Effizienz liefern zusammen in der Regel einen höheren Durchsatz. An einem Arbeitstag können mehr Proben analysiert werden. Größere Mengen der Verbindung können pro Lauf oder Prozessierungszeitraum gereinigt werden.

Stationäre Phase*

Eine der beiden Phasen, die ein Chromatographiesystem bilden. Es kann ein Feststoff, ein Gel oder eine Flüssigkeit sein. Wenn es sich um eine Flüssigkeit handelt, kann sie auf einem Feststoff verteilt sein. Dieser Feststoff kann zum Trennprozess beitragen oder auch nicht. Die Flüssigkeit kann auch chemisch an den Feststoff gebunden [gebundene Phase] oder darauf immobilisiert sein [immobilisierte Phase].

Der Ausdruck Chromatographiebett oder Sorbens kann als allgemeiner Begriff verwendet werden, um jede der verschiedenen Formen zu bezeichnen, in denen die stationäre Phase verwendet wird.

Von der Verwendung des Begriffs Flüssigphase zur Bezeichnung der mobilen Phase in der LC wird abgeraten. Dadurch wird eine Verwechslung mit der Gaschromatographie vermieden, bei der die stationäre Phase als flüssige Phase bezeichnet wird [meistens eine auf einen festen Träger aufgetragene Flüssigkeit].

Die Flüssig-Flüssig-Chromatographie [LLC] mit offener Säule ließ sich nicht gut auf HPLC übertragen. Sie wurde durch die Verwendung von Packungen mit gebundener Phase ersetzt. LLC erwies sich aufgrund von Problemen mit dem Ablaufen der stationären Phase-Flüssigkeit-Beschichtung vom festen Träger als mit modernen Detektoren nicht kompatibel, wodurch die nicht mischbare flüssige mobile Phase verunreinigt wurde.

UPLC-Technologie

Der Einsatz eines hocheffizienten LC-Systems, das ganzheitlich für Sub-2-μm-Partikel und sehr hohen Betriebsdruck ausgelegt ist, wird als Ultra-Performance-Flüssigchromatographie [UPLC-Technologie] bezeichnet.† Die Hauptvorteile dieser Technologie sind die signifikante Verbesserung der Auflösung gegenüber der HPLC und/oder schnellere Laufzeiten bei Beibehaltung der Auflösung, die bei einer bestehenden HPLC-Trennung festgestellt wurde.

Weitere Informationen finden Sie unter https://www.waters.com/uplc