Leitfaden für Einsteiger in die Convergence-Chromatographie

Wie im vorigen Kapitel besprochen, ähnelt die CC hinsichtlich der Trennung sehr stark der LC. Auch vom Gerätestandpunkt her ähnelt die CC in jeder Hinsicht einem LC-System (siehe Abbildung 7), mit Ausnahme einer zusätzlichen Komponente, dem ABPR, der das gesamte System über einen Sollwert hinaus unter Druck setzt. Um die Vorteile der CO₂-basierten mobilen Phase zu nutzen und ihr die modernen Vorteile der UPLC zu geben, hat Waters das drucktolerante ACQUITY UPLC System mit geringer Dispersion modifiziert, indem zentrale Systemkomponenten mit einem komprimierbaren Lösungsmittel wie CO_{2 kompatibel gemacht wurden.} Dazu gehörte vor allem die Pumpe für verflüssigtes CO₂ zur Messung des Flusses durch das CC-System. Obwohl das CO₂ zuerst verflüssigt wird (z. B. bei 13 °C) ist es fast dreimal komprimierbarer als Methanol oder Acetonitril. Daher musste die Pumpe für eine reproduzierbare Convergence-Chromatographie modifiziert werden.

Herausforderungen früherer analytischer SFC-Systeme

Historisch gesehen waren analytische SFC-Systeme notorisch unzuverlässig. Alle von ihnen waren umfunktionierte LC-Systeme. Pumpen, Injektoren und Detektoren, die für die LC entwickelt wurden, sind nicht für den Betrieb mit komprimiertem CO₂ ausgelegt.

Einstufige LC-Kolbenpumpen konnten CO₂ nicht genau, reproduzierbar und zuverlässig komprimieren und liefern. Sie sind nicht für den Betrieb mit einer so komprimierbaren Flüssigkeit wie CO₂ ausgelegt, was zu variablen Massendurchflussraten der mobilen Phase sowie zu unterschiedlichen Massenzusammensetzungen führt. Dies ändert das Solvatationsvermögen der mobilen Phase und zeigt sich oft als Verschiebung der Retentionszeiten von Injektion zu Injektion oder von System zu System.

Hochkomprimierbare mobile Phasen auf CO₂-Basis beeinträchtigen außerdem die analytische Empfindlichkeit aufgrund des durch die Pumpe und den Rückdruckregler erzeugten Rauschens. Außerdem sind HPLC-Geräte aufgrund erheblicher Probleme der geringen Genauigkeit und Präzision bei Teilschleifeninjektionen häufig auf Vollschleifeninjektionen beschränkt, was die Auswahl des Injektionsvolumens einschränkt Auf Systemebene zeichnen sich umgerüstete HPLC-Systeme durch ein erheblich größeres Systemdispersionsvolumen aus, was eine unerwünschte Bandenverbreiterung verursacht und den Einsatz effizienterer Säulen mit 1,7-mm-Partikeln verhindert. Diese Nachteile schränken den potenziellen Durchsatz und die erreichbare Leistung eines umgerüsteten LC-CO₂-Systems stark ein.

Als nächstes führen wir Sie durch einen Überblick über die Neuerungen, die an jedem einzelnen Modul des ACQUITY UPC² Systems vorgenommen wurden (Abbildung 7).

Lösungsmittelmanagement-Technologie (die Pumpe)

Um die genaue und präzise Steuerung der Flussraten und der Zusammensetzung der mobilen Phase sicherzustellen, müssen wir den gesamten Flussweg des Systems betrachten. Wie bereits erwähnt, sind umgerüstete HPLC-Pumpen, die das angegebene Lösungsmittelvolumen sowohl komprimieren als auch genau fördern, nicht in der Lage, eine so komprimierbare Flüssigkeit wie flüssiges CO₂ zu fördern. Bei einigen SFC-Geräten wird das einströmende CO₂ durch ein Gerät vorkomprimiert und gekühlt. Dieses Gerät befindet sich neben dem Chromatographiesystem (Abbildung 8). Je weiter dieses Gerät von der Pumpe entfernt ist, desto schwieriger ist es, die Flussrate des CO₂-Massendurchflusses genau zu steuern, da sich die CO₂-Dichte zwischen dem Vorkomprimierungs- und dem Pumpschritt je nach Umgebungstemperatur ändern kann. Darüber hinaus haben die Pumpenalgorithmen (interne Steuerungssoftware) herkömmlicher SFC-Systeme, die im Allgemeinen für die Förderung relativ inkomprimierbarer Flüssigkeiten ausgelegt sind, Schwierigkeiten, die Genauigkeit der Zusammensetzung, die Präzision und die Reproduzierbarkeit der Retentionszeit aufrechtzuerhalten. Die gleichen Probleme treten auf, wenn versucht wird, niedrige Prozentsätze von Hilfslösungsmittel (weniger als 5 %) zuverlässig zu liefern, was die Analyse von Gemischen mit unterschiedlicher Polarität erschwert.

Im Gegensatz dazu wurde der Waters ACQUITY UPC² Binäre Solvent Manager (BSM) mit einem vollständig integrierten Vorkomprimierungsgerät zur außergewöhnlich präzisen Steuerung der Massendurchflussrate und Massenzusammensetzung speziell für das Management komprimierbarer Flüssigkeiten entwickelt, was zu zuverlässigen, reproduzierbare Retentionszeiten und vernachlässigbarem Basislinienrauschen führt. Wie bereits erwähnt, steuert die Lösungsmitteldichte in einem komprimierbarem Flüssigkeitssystem das Solvatationsvermögen der mobilen Phase, daher ist eine präzise Steuerung für die Reproduzierbarkeit entscheidend. Getrennte Steueralgorithmen, die für komprimierbare und nicht-komprimierbare Flüssigkeitskomponenten erforderlich sind, mischen verschiedene Zusammensetzungen der mobilen Phase, einschließlich niedriger Prozentsätze von Hilfslösungsmittel (Abbildung 9) und liefern reproduzierbare Gradientenprofile (Abbildung 10).

Analytische SFC-Systeme haben noch nie ein so feines Kontrollniveau erreicht, insbesondere für Gradiententrennungen. Das ACQUITY UPC² System wurde zur präzisen Steuerung von Pumpeneinlass, Kompression und Förderung entwickelt, um die von einer Ultra Performance LC erwartete Reproduzierbarkeit zu erreichen. Die volumetrische Dichtesteuerung des ACQUITY UPC² BSM übertrifft die der Massenflusssteuerung und sorgt für eine außergewöhnliche chromatographische Präzision. Dies führt zu kontrollierten Elutionszeiten und einer hervorragenden Kontrolle der Solvatationsstärke. Die Pumpenköpfe selbst werden unabhängig gekühlt, was die Steuerung über die Dichte von CO₂ und damit die genaue Massenförderung verbessert. Die Pumpen- und integrierten Kompressionsalgorithmen sind so effektiv und die Steuerung so präzise, dass als mobile Anfangsphase entweder flüssiges oder gasförmiges CO₂ verwendet werden kann. Abbildung 11 zeigt das Innenleben des BSM. Die Pumpe für das Hilfslösungsmittel ist eine UPLC-Pumpe, während sich die CO₂-Pumpe hinter der isolierten schwarzen Abdeckung befindet. Da das Kompressions- und Kühlgerät in die Pumpe integriert ist, ermöglicht diese isolierte Abdeckung eine genauere Steuerung der Dichte des einfließenden CO₂.

Probeninjektion

Traditionelle analytische SFC-Systeme – unabhängig davon, ob sie Vollschleifen- oder Teilschleifeninjektoren verwenden – haben Schwierigkeiten, kleine Probenvolumina reproduzierbar zu injizieren. In den meisten Fällen sind nur Vollschleifeninjektionen möglich; bei Teilschleifeninjektionen ist es schwierig, die Homogenität des Injektionslösungsmittels aufrechtzuerhalten. Daher leiden Genauigkeit, Präzision und Linearität darunter, was eine Quantifizierung des Analyten verhindert. Große Probenmengen können bei jeder Injektion verschwendet werden, so dass die Probenschleife bei Bedarf sehr oft manuell gewechselt werden muss, was die Flexibilität des Systems einschränkt.

Der ACQUITY UPC² Sample Manager hat ein neuartiges Design für das Doppelinjektionsventil (Abbildung 12). Dadurch wird die primäre Probenschleife zum Abfall entlüftet, sodass die Probe unter Atmosphärendruck in die Schleife gelangen kann, während die Homogenität der mobilen Phase aufrechterhalten wird. Darüber hinaus wurde das zusätzliche Injektionsventil entwickelt, um Druckimpulse aus der Injektionssequenz zu reduzieren und Verschleppung zu mildern, wodurch wiederholbare und reproduzierbare Teilschleifeninjektionen ermöglicht werden (Abbildung 13). Injektionen von 0,1 bis 50 μL können in 0,1-μL-Schritten durchgeführt werden. Durch die doppelte Nadelwaschoption kann die Probenverschleppung vernachlässigt werden. Abbildung 14 zeigt die Injektionslinearität bei Teilschleifeninjektion von 1 bis 10 mL in 1-mL-Schritten.

Optischer Detektor

Die optische Detektion ist bei analytischen SFC-Systemen manchmal mühsam. Für HPLC-Systeme entwickelte Detektorflusszellen können zu einem unzulässigen Dispersionsvolumen und Basislinienrauschen führen. Brechungsindex-Detektoren verursachen bei der SFC mit einer komprimierbaren Flüssigkeit ein erhebliches Basislinienrauschen und eine Drift, wodurch das vom Pumpensystem erzeugte Rauschen verstärkt wird. Lösungsmittel wie Methanol und Wasser, die üblicherweise bei der RP-LC verwendet werden, haben sehr ähnliche RI-Werte (Abbildung 15), sodass RI-Effekte bei Reversed-Phase-Methoden normalerweise nicht so signifikant sind. CO₂ hat einen Wert, der sich stark von Methanol (dem am häufigsten verwendeten Hilfslösungsmittel) unterscheidet, wodurch der Bereich der Brechungsindizes von Substanzen größer als in der LC ist, was das Basislinienrauschen erhöht und die Empfindlichkeit einschränkt. Als weitere Herausforderung ändert sich die Dichte und damit der Brechungsindex einer CO₂-basierten mobilen Phase im Verlauf einer Gradientenanalyse.

Der ACQUITY UPC² PDA Detektor wurde speziell für komprimierbare Flüssigkeiten entwickelt. Anstelle von Saphirlinsen, die den Energiedurchsatz bei niedrigeren UV-Wellenlängen verringern, bestehen die Linsen des ACQUITY UPC² PDA Detektors aus hochfestem Silika, das dem während einer Trennung erzeugten Rückdruck standhält. Dies trägt dazu bei, die Empfindlichkeit zu maximieren, das Basislinienrauschen zu reduzieren und Unterschiede der RI-Effekte zwischen CO₂ und dem organischen Hilfslösungsmittel auszugleichen. Die optische Bank wird thermisch gesteuert, um die Basislinienstabilität weiter zu verbessern und RI-Effekte abzuschwächen. Eine Flusszelle aus Edelstahl mit geringer Dispersion eignet sich für schmale Peakbreiten, während die Weglänge von 10 mm die Empfindlichkeit maximiert und gleichzeitig eine optimale spektrale Leistung aufrechterhält. Die außergewöhnliche erreichbare Empfindlichkeit ermöglicht die Quantifizierung von Verunreinigungen im Spurenbereich (Abbildung 16).

Massenspektrometerdetektion (MS-Detektion)

Ähnlich den einzigartigen Geräteanforderungen für die Anpassung der optischen Detektion für die komprimierbare mobile Phase der CC, erfordert die Anbindung der CC an MS Modifikationen, um die Komprimierbarkeit der mobilen Phase zu berücksichtigen. Die CC-MS-Schnittstelle muss es der mobilen Phase ermöglichen, in der Ionenquelle heutiger Massenspektrometer vom Druckzustand auf Atmosphärendruck zu dekomprimieren. Ohne sorgfältige Berücksichtigung der Komprimierbarkeit der mobilen Phase kann der Analyttransport in die Ionenquelle negativ beeinflusst werden. Schlechter Analyttransport kann zu einer schlechten Peakform und/oder schlechten Ionisierungen führen. Im schlimmsten Fall tritt keine Ionisierung auf und der nachzuweisende Analyt wird vom Massenspektrometer nicht erkannt.

Die Dekompression der komprimierten mobilen Phase muss unabhängig von der Flussrate der mobilen Phase, der Zusammensetzung der mobilen Phase und dem Druck des Nachsäulensystems, der durch den automatischen Rückdruckregler (ABPR) eingestellt wird, gesteuert werden. Außerdem muss die Dekompression ohne Einbußen beim effizienten Analyttransport in die Ionenquelle erfolgen. Um diese Ziele zu erreichen, wurde das ACQUITY UPC² Massenspektrometer für eine komprimierbare mobile Phase entwickelt und verwendet eine Split-Flow-Schnittstelle mit einer Makeup-Flüssigkeit. Die Massenspektrometrieschnittstelle leitet eine konstante Flussrate der mobilen Phase, normalerweise zwischen 300 und 500 µL/min (komprimiert), durch die geteilte Drossel zum Massenspektrometer. Der verbleibende Teil der mobilen Phase wird zur Steuerung des Nachsäulendrucks über einen weiten Bereich von Flussraten und Zusammensetzungen der mobilen Phase zum ABPR geleitet. Eine schematische Darstellung der ACQUITY UPC² Massenspektrometrieschnittstelle wird in Abbildung 17 gezeigt, die die geteilte Schnittstelle und die Zugabe von Makeup-Flüssigkeit hervorhebt.

Die Makeup-Flüssigkeit in der CC-MS-Schnittstelle hat mehrere Funktionen. Sie ist in erster Linie für den Betrieb mit Elektrospray-Ionisierung (ESI) unter einem Zusatz von etwa 5 % erforderlich Da es sich bei ESI um eine Flüssigphasen-Ionisierungstechnik handelt, ist für die Ionisierung eine gewisse Flüssigkeitsmenge erforderlich. Daher reicht die in der mobilen Phase vorhandene Flüssigkeitsmenge für die ESI nicht aus, wenn der Anteil des Modifikators in der mobilen Phase sehr niedrig ist. Deshalb ist für die ESI bei niedrigen Modifikatoranteilen die Zugabe von Flüssigkeit in Form eines Makeup-Flusses erforderlich. Zum anderen kann die Makeup-Flüssigkeit beim Transport des Analyten helfen. Irgendwann entlang der geteilten Drossel geht das CO₂ vom dichten Zustand unter hohem Druck in den gasförmigen Zustand über und verliert seine Solvatationskraft. Dementsprechend steht nach dem Übergang des CO₂ in ein Gas nur der flüssige Modifikator zur Verfügung, um die Analyten zu lösen und in die Ionenquelle zu transportieren. Wenn bei der Trennung keine oder nur sehr geringe Modifikatoranteile verwendet werden, steht keine Flüssigkeit zur Verfügung, um die Analyten zur Ionisierung durch die geteilte Drossel in die Ionenquelle zu transportieren. Makeup-Flüssigkeit wird stromaufwärts der geteilten Drossel zugegeben, um unter solchen Bedingungen den Transport von Analyten in die Ionenquelle zu erleichtern. Ein Beispiel für Peakprofile, die auf einen guten und schlechten Analyttransport hinweisen, wird in Abbildung 18 gezeigt. In diesem Fall wurde die Flussrate der Makeup-Flüssigkeit für schlechten Analyttransport (18A) und guten Transport (18B) ausgewählt.

Die Makeup-Flüssigkeit ist auch für den Transport von Analyten wichtig, wenn der Analyt in dem flüssigen Modifikator der mobilen Phase nur begrenzt löslich ist. Manchmal ist der Analyt in dem Gemisch aus flüssigem Modifikator und komprimiertem Kohlendioxid gut löslich, aber in dem flüssigen Modifikator allein weniger löslich. In diesen Fällen kann der Analyt aus der Lösung ausfallen, nachdem das CO₂ in der geteilten Drossel in den gasförmigen Zustand übergegangen ist, selbst wenn hohe Anteile an flüssigem Modifikator vorhanden sind. Wenn die Löslichkeit des Analyten im flüssigen Modifikator nicht ausreicht, führt dies zu einer schlechten Peakform, einem Verstopfen der Verbindungsleitungen und/oder einer schlechten Reproduzierbarkeit der Peaks. Die Zugabe einer geeigneten Makeup-Flüssigkeit kann helfen, solche Schwierigkeiten zu vermeiden, indem die Löslichkeit des Analyten in dem neu gebildeten Gemisch aus flüssigem Modifikator und Makeup-Flüssigkeit erhöht wird. Hochlipophile Analyten können zum Beispiel in einer mobilen Phase aus CO₂/Methanol gut löslich sein und in Methanol allein relativ unlöslich. In diesem Fall kann eine unpolare Makeup-Flüssigkeit zugesetzt werden, um die Nettopolarität des Gemischs aus flüssigem Modifikator und Makeup-Flüssigkeit zu verringern. Der lipophile Analyt ist in dem Flüssigkeitsgemisch mit niedriger Polarität besser löslich und wird daher leichter in die Ionenquelle transportiert.

Bei Bedarf führen Makeup-Flüssigkeiten in der CC-MS-Schnittstelle auch ionisierungsverstärkende Verbindungen in das Massenspektrometer ein. Diese Verbindungen können nach der Säule hinzugefügt werden, ohne die Trennung zu beeinträchtigen. Ionisierungsverstärkende Verbindungen wie 5 Volumen-% Wasser und/oder 20 mM einer Verbindung aus Ammoniumhydroxid, Ameisensäure oder Ammoniumacetat können bei der ESI häufig die Ionisierungseffizienz erhöhen. Die Konzentration und Art der ionisierungsverstärkenden Verbindung sind sehr analytspezifisch und sollten für ein optimales Signal auf die jeweilige Applikation abgestimmt werden.

Sobald die Zusammensetzung der Makeup-Flüssigkeit ausgewählt wird, kann für ein optimales Signal auch die Flussrate der Makeup-Flüssigkeit abgestimmt werden. Ein Bereich von Flussraten kann gegen die MS-Signalstärke überprüft werden. Eine zu niedrige Flussrate kann zu schlechtem Transport führen, während eine zu hohe Makeup-Flussrate oft zu einem verringerten MS-Signal führt. Die optimale Flussrate der Makeup-Flüssigkeit ist zusammen mit der Zusammensetzung der Makeup-Flüssigkeit analyt- und methodenspezifisch. Wenn ein maximales Signalverhalten gewünscht wird, sollte diese bei jeder neuen Applikation optimiert werden. Außerdem sollten die Zusammensetzung der Makeup-Flüssigkeit und die Flussrate beim Umschalten zwischen Ionisierungstechniken, wie zum Beispiel beim Umschalten von ESI zu chemischer Ionisierung unter Atmosphärendruck (APCI), erneut optimiert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die ACQUITY UPC² Massenspektrometrieschnittstelle speziell für eine komprimierbare mobile Phase und für den Anschluss an ein modernes Massenspektrometer mit Atmosphärendruck-Ionisierungstechniken wie ESI, APCI, ESCi Multi-Mode-Ionisierung, Atmosphärendruck-Photoionisierung (APPI) und UniSpray entwickelt wurde.

Rückdruckregler

Einer der kritischsten Teile eines Systems, der Umgang mit komprimierbaren Lösungsmitteln, ist die Möglichkeit, den Druck im System genau zu steuern und aufrechtzuerhalten. Wie wir gesehen haben, kann eine unpräzise Steuerung des Rückdrucks die Dichte der mobilen Phase und damit die Solvatations- und Retentionszeiten des Analyten stark beeinflussen. Herkömmliche SFC-Systeme weisen aufgrund mehrerer Faktoren häufig eine ungenaue Steuerung des Rückdrucks auf, wie z. B.: schlechte Drucküberwachung am Rückdruckregler (ABPR), langsam reagierende Feedback-Schleifen, Schrittmotoren mit niedriger Auflösung, schlechte Steuerung des Drucks und des Flusses der Pumpe sowie die Verschlechterung der ABPR-Komponenten im Laufe der Zeit.

Das ACQUITY UPC² System bietet eine verbesserte Rückdrucksteuerung durch ein innovatives zweistufiges aktives und statisches BPR (Abbildung 19). Durch diese Kombination aus aktiver und statischer Rückdrucksteuerung hält der statische BPR das System auf einem minimalen Druck, während der aktive BPR die Steuerung des vom Anwender definierten Sollwerts verbessert (Abbildung 20). Zur weiteren Verbesserung der Robustheit wird der statische BPR-Einsatz beheizt, um das Gefrieren der mobilen Phase abzumildern, das bei schneller Dekompression am ABPR-Auslass auftreten kann. Der zweistufige BPR befindet sich im ACQUITY UPC² Convergence Manager (CM) (Abbildung 21). Dieses Modul enthält auch den integrierten Partikelfilter für das eingehende CO₂, den CO₂-Leckdetektor, das Entlüftungsventil, das Druckbegrenzungsventil und das zusätzliche Injektionsventil.

Gesamtsystemleistung

Schließlich hat das ACQUITY UPC² System wie die ACQUITY UPLC Systeme von Natur aus eine niedrige Dispersion, was die Verwendung kleinerer Innendurchmesser und Säulen mit kleinerer Partikelgröße ermöglicht (Abbildung 22). Säulen mit kleinem Durchmesser erhöhen die Empfindlichkeit, sparen Lösungsmittel und nutzen Flussraten, die für die Massenspektrometrie geeigneter sind. Säulen mit kleineren Partikelgrößen erhöhen die Trennleistung und verbessern die Auflösung.