Leitfaden für Einsteiger in die Convergence-Chromatographie

Aufgrund des zuvor beschriebenen erweiterten Selektivitätsbereichs der Convergence-Chromatographie ist die Technik für eine Vielzahl von Applikationen geeignet (Tabelle 5).

Unabhängig vom Marktgebiet oder der genauen Art der getesteten Analyten hilft die CC auf drei Arten, analytische Herausforderungen zu meistern:

• Convergence-Chromatographie vereinfacht den Workflow
• Convergence-Chromatographie trennt Verbindungen mit ähnlicher Struktur
• Die Convergence-Chromatographie ist ein orthogonales Trennverfahren zur Reversed-Phase LC

Als nächstes erklären wir die wichtigsten Vorteile der CC anhand einiger Applikationsbeispiele.

Eine der nützlichsten Entdeckungen bei der Entwicklung von der SFC zur CC ist, wie sich komprimiertes CO₂ mit einer Vielzahl organischer Lösungsmittel vermischt, um chromatographische Analysen auf bisher nicht mögliche Weise durchzuführen. In diesem Abschnitt erklären wir, wie die CC den Workflow in einem Analyselabor drastisch vereinfachen kann.

Die Vereinfachung eines Workflows, von der ersten Probennahme bis zur endgültigen Analyse, hat im Allgemeinen in jedem Analyselabor die größten Auswirkungen auf das Geschäft. Die CC kann den Workflow vieler Applikationen drastisch vereinfachen, was zu Kosten- und Zeiteinsparungen, geringerem Fehlerpotenzial und höherer Produktivität führt. Einige dieser Eigenschaften umfassen:

• Kombination mehrerer Techniken (LC und GC)
• Kombinieren mehrerer Methoden (Normalphasen-LC und Reversed-Phase LC)
• Verkürzung der Probenvorbereitungszeit

Kombination mehrerer Techniken – Lipidanalyse

Die Analyse von Lipiden ist aus vielen Gründen wichtig. In der pharmazeutischen Industrie werden Lipidprofile untersucht, um den Einfluss der Arzneimittelwirksamkeit bei Kontrollpersonen und Personen mit Dosierungen zu bestimmen.

In der klinischen Forschung werden Lipidspiegel als Biomarker bei verschiedenen Erkrankungen sowie im Hinblick auf die Wirksamkeit der Behandlung untersucht. Bei Lebensmittelapplikationen werden bestimmte Lipidklassen, wie z. B. Triglyceride, aus ernährungsphysiologischen Gründen oder zur Bestimmung der Produktechtheit bestimmt. Bei chemischen Materialien werden Fettsäuren und Triglyceride in Mineralölprodukten (z. B. Biodiesel) analysiert. Je nach gewünschtem Ergebnis erfordert die Analyse von Lipiden unterschiedliche Techniken. Bei freien Fettsäuren ist dies typischerweise die GC und erfordert eine Derivatisierung der freien Fettsäure zum Fettsäuremethylester (FAME), um die Peakform und die Nachweisgrenzen, insbesondere bei längeren Kohlenstoffketten, zu verbessern. Die Derivatisierung kann mehrere Stunden dauern und die resultierende GC-Analyse kann bis zu 30 Minuten dauern. Polarere Lipide, wie Phospholipide und Sphingolipide erfordern häufig HILIC oder Normalphasen-LC, um die verschiedenen Lipidklassen zu trennen (basierend auf der Art der polaren Kopfgruppe). Dann wird die Reversed-LC verwendet, um die hydrophoberen Lipide innerhalb einer Klasse anhand der Länge der Kohlenstoffkette und/oder der Anzahl der Doppelbindungen zu bestimmen. Wie wir sehen, erfordert ein vollständiges Lipidprofil mehrere Techniken. Dies ist bei der CC, bei der alle Klassen von Lipiden in einer einzigen Injektion getrennt werden, nicht der Fall. Abbildung 40 zeigt das umfassende Lipidprofil eines Mausherzextrakts unter Verwendung des ACQUITY UPC² Systems. In diesem Beispiel trennen eine BEH-Säule und ein generischer Gradient die verschiedenen Lipidklassen, was zu einer ähnlichen Trennung führt, wie sie durch Normalphasen-LC oder HILIC erfolgt.

Für die neutralen Lipide (d. h. Triacylglycerin (TG), Diacylglycerin (DG), Cholesterinester (CE) und freie Fettsäuren) werden durch eine einfache Änderung der Säulen- und Gradientenbedingungen die unterschiedlichen Lipide innerhalb jeder Klasse basierend auf der Kettenlänge und der Anzahl der Doppelbindungen der Fettsäure reteniert und getrennt (Abbildung 41).

Die CC ist bei dieser Applikation nicht nur schneller als die GC (bis zu 10 Mal schneller), sondern es ist auch keine Derivatisierung erforderlich, wodurch der gesamte Workflow für die Lipidanalyse erheblich vereinfacht wird. Das Entfallen einer Derivatisierung spart Zeit und minimiert potenzielle Fehler beim Hinzufügen dieser zusätzlichen Schritte zum Workflow. Ohne die CC kann diese Art der Profilerstellung und der gezielten Analyse bis zu drei verschiedene Techniken erfordern, was zu einem geringeren Probendurchsatz, einem höheren Lösungsmittelverbrauch, längeren Laufzeiten und insgesamt höheren Analysekosten führt.

Kombination mehrerer LC-Methoden – Fettlösliche Vitamine

Die Analyse fettlöslicher Vitamine ist für die pharmazeutische Industrie, die klinische Forschung und Diagnostik sowie die Lebensmittel- und Kraftstoffindustrie wichtig. Die Analyse fettlöslicher Vitamine und Carotinoide erfolgt typischerweise entweder durch Reversed-Phase- oder Normalphasen-LC (Tabelle 6). Da es schwierig ist, diese Verbindungen in einer einzigen Injektion zu trennen, werden sie einzeln mithilfe verschiedener Säulen und mobiler Phasen mit Analysezeiten zwischen 10 und 30 Minuten analysiert. Vergleichen Sie das mit der CC, die alle Vitamine und verwandten Verbindungen in weniger als 10 Minuten analysiert (Abbildung 42). Im Gegensatz zu den in Tabelle 6 aufgeführten traditionellen Analysemethoden erfordert die optimierte CC-Methode die Verwendung einer einzelnen Säule, einer mobilen Phase und eines Detektors. Bei der CC werden die Lösungsmittel oft direkt injiziert, wobei die gleichen Lösungsmittel verwendet werden, die zum Extrahieren oder Auflösen dieser Verbindungen verwendet werden (z. B. Isooctan und Hexan). Der Lösungsmittelaustausch, der normalerweise für die Reversed-Phase-Analyse erforderlich ist, ist nicht notwendig.

Verkürzung der Probenvorbereitungszeit

Zusätzlich zu einer schnelleren Trennung von Analyten, da mehrere Techniken und Methoden in einer kombiniert werden können, kann die CC häufig die Probenvorbereitungszeit verkürzen. Die Kompatibilität der CC mit organischen Lösungsmitteln führt zu folgenden Vorteilen:

• Wegfall von Hydrolyse- und/oder Derivatisierungsschritten
• Vermeidung von Verdunstung und Rekonstitution für den Lösungsmittelaustausch
• Verringerung der Anzahl der Handhabungsschritte, wodurch experimentelle Fehler reduziert werden und die Datenqualität verbessert wird

Betrachten Sie zum Beispiel die zahlreichen Schritte der Probenvorbereitung und Analysen, die für fettlösliche Vitamine in Lebensmitteln erforderlich sind. Ein typischer Probenworkflow zur Analyse der Vitamine A, D und E in Lebensmitteln ist in Abbildung 43 dargestellt. Beachten Sie, dass für die Vitamine A und E ein anderes Verfahren zur Probenvorbereitung erforderlich ist als für Vitamin D. Außerdem sind drei separate HPLC-Analysen (sowohl Normalphase als auch Reversed-Phase) für jedes Vitamin erforderlich. Die Probenvorbereitung für die Vitamin-D-Analyse ist besonders komplex und kann viele Schritte umfassen, einschließlich in einigen Fällen einen semi-präparativen HPLC-Schritt.

Die Probenvorbereitung zur Analyse derselben Vitamine mithilfe der CC ist aufgrund der Kompatibilität der Technik mit den unpolaren organischen Lösungsmitteln, die zu Beginn des Extraktionsverfahrens verwendet werden, viel einfacher (Abbildung 44). Im Beispiel können wir Vitamin E quantifizieren, indem wir die Probe direkt aus der Hexanextraktion injizieren. Es wird dann für die Analyse der Vitamine A und D3 konzentriert, wodurch die Laufzeit zwanzigmal schneller ist als bei herkömmlichen Analysemethoden. Außerdem sind für die CC nur drei Probenvorbereitungsschritte, eine Methode und ein einzelnes Gerät erforderlich, während der in Abbildung 43 gezeigte traditionelle Workflow 12 Probenvorbereitungsschritte und drei Methoden auf zwei verschiedenen Geräten erfordert. Tabelle 7 fasst die Vorteile der CC für die besprochenen Applikationen zusammen und hebt andere hervor, bei denen analytische Wissenschaftler von einer ähnlichen Vereinfachung profitieren würden.

Schnelle Trennung strukturell ähnlicher Verbindungen

Isomere und Strukturanaloga sind manchmal aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit schwer zu trennen, insbesondere bei optischen Isomeren. Wir besprechen nun die Verwendung der CC für die folgenden strukturell ähnlichen Verbindungen:

• Chirale Trennungen (Enantiomere und Diastereomere)
• Positionsisomere (mit unterschiedlicher Position der funktionellen Gruppen)
• Strukturanaloga
  • Biomarker (konjugiert/unkonjugiert)
  • Medikamente (Metaboliten, Verunreinigungen, Abbaumittel)

Häufig können verschiedene Enantiomere einer Verbindung unterschiedliche Potenz- und Toxizitätsprofile aufweisen und müssen daher während der gesamten Forschungs-, Entwicklungs- und Produktionsphase überwacht werden. Chirale Trennungen werden überwiegend durch Normalphasen-LC unter Verwendung von stationären Phasen auf Zellulose- oder Amylosebasis durchgeführt. Bei der Normalphasen-LC sind Gradiententrennungen nicht einfach durchzuführen. Sie erfordern unterschiedliche, isokratische Analysen auf unterschiedlichen Säulen, mit unterschiedlichen mobilen Phasenkombinationen und oft mit hochtoxischen Lösungsmitteln. Der Prozess der Methodenentwicklung kann sehr zeitaufwendig sein. Die Möglichkeit, Gradienten zu starten und einen weiten Selektivitätsbereich abzudecken, ist bei der CC mit ungiftigen Lösungsmitteln möglich. Dadurch können Analytiker an einem einzigen Tag chirale Trennungen entwickeln.

Chemiker im Bereich der Aufreinigung haben seit vielen Jahren den Wert der SFC für diese Art der Trennung erkannt. Analytische SFC-Trennungen sind für schnelle chirale Screenings, für die Entwicklung chiraler Methoden, für die Bestimmung von Überschüssen an Enantiomeren und für chirale Inversionsstudien sehr interessant, auch wenn sie schwierig durchzuführen sind. Im Gegensatz zur Normalphasen-LC ist die CC in hohem Maße mit dem massenspektroskopischen Nachweis kompatibel, wodurch Enantiomere und ihre Bildung bei Reaktionen, Herstellungsprozessen und in biologischen Systemen identifiziert und charakterisiert werden können (Abbildung 45).

Abbildung 46 vergleicht Normalphasen- und Convergence-Chromatographie zur Trennung der Warfarin-Enantiomere. Die CC-Basislinie trennt die Enantiomere in einem Bruchteil der Zeit gegenüber der Normalphase (bis zu 30-mal schneller). Außerdem werden durch den Wegfall toxischer Lösungsmittel, deren Anschaffung und Entsorgung kostspielig sind, die Kosten für chirale Trennungen pro Analyse um das 100-fache gesenkt. All diese Vorteile machen die CC zur bevorzugten Technik für chirale Analysen aller Art.

Positionsisomere und Strukturanaloga

Die CC ist zur Trennung von Positionsisomeren und anderen Strukturanaloga nützlich. Positionsisomere sind Verbindungen mit demselben Molekulargewicht (isobar), unterscheiden sich jedoch in der Lage ihrer funktionellen Gruppen. Sie werden häufig bei Applikationen wie der Analyse von Ausgangsmaterialien, der Überwachung von Reaktionen und der asymmetrischen Katalyse eingesetzt. Häufig werden diese Verbindungen vor der GC-Analyse derivatisiert, um die Trennung der Isomeren zu unterstützen. Normalphasen-LC-Methoden sind von Natur aus weniger robust und langsamer. Andererseits werden aufgrund der Selektivität von CC-Trennungen Positionsisomere ohne Derivatisierung unter allgemeinen Bedingungen problemlos getrennt.

Das ACQUITY UPC² System (Abbildung 47) trennt Isomere so schnell, dass es die Optimierung von Ausgangsstoffen, Zwischen- und Endprodukten in Echtzeit beurteilen kann. Strukturanaloga sind aufgrund ihrer Ähnlichkeit schwer zu trennen und können konjugierte oder unkonjugierte (z. B. Glucuronide, Sulfate), Biomarker sowie Metaboliten, Abbauprodukte und Verunreinigungen von Arzneimittelwirkstoffen enthalten. Steroide sind eine der gängigsten Klassen von Strukturanaloga (Abbildung 48). Die strukturelle Ähnlichkeit zwischen verschiedenen Steroiden macht es aufgrund der geringen Massenunterschiede schwierig, diese zu trennen und zu analysieren, selbst bei Verwendung von MS-Detektion. Sie sind mit der CC mithilfe eines generischen Screening-Gradienten auf mehreren Säulen in weniger als zwei Minuten aufzulösen (Abbildung 49). Diese Trennung ist für Reversed-Phase LC aufgrund der unpolaren Art der Verbindungen eine Herausforderung und die GC erfordert eine Derivatisierung, um die Peakform und die Nachweisgrenzen zu verbessern. Die Kopplung des ACQUITY UPC² Systems mit MS-Detektion ist eine zuverlässige Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von Steroiden.

Konjugierte Strukturanaloga sind schwieriger zu trennen. Freie Steroide (Abbildung 48) sind wasserunlöslich, daher wandelt der Körper sie in wasserlösliche Derivate um, indem er sie in ihre sulfatierte Form umwandelt. Dieser Vorgang führt zu einer negativ geladenen hydrophilen Seitengruppe, die sie wasserlöslich macht (Abbildung 50). Diese Verbindungen werden zur therapeutischen Verwendung aus natürlichen Quellen isoliert und als Biomarker zur Untersuchung von Erkrankungen und zur Bestimmung der Wirksamkeit der Behandlung verwendet. Die Analyse dieser Verbindungen bringt zwei große Herausforderungen mit sich.

Zunächst dauert es 2,5 Stunden, um eine Probe für eine 30-minütige GC-Analyse vorzubereiten, die eine enzymatische Hydrolyse der Sulfatgruppe gefolgt von einer Derivatisierung erfordert. Zweitens kann die Massenspektrometrie einige dieser Östrogene nicht unterscheiden, da sie isobar sind (gleiches m/z). Daher ist eine Chromatographie erforderlich, um die verschiedenen Formen der isobaren Verbindungen zu trennen.

Mit der CC können alle 10 sulfatierten Östrogene in 15 Minuten getrennt werden (Abbildung 51), einschließlich zweier nah beieinander eluierender Peaks (Peaks 6 und 7), die durch eine 30-minütige GC-Analyse nicht einfach getrennt werden können (Abbildung 52). Bei der CC muss die Probe nicht hydrolysiert und derivatisiert werden, da die sulfatierten Verbindungen in ihrer nativen Form analysiert werden können. Dies reduziert die Anzahl der erforderlichen Schritte zur Analyse therapeutischer Formulierungen erheblich und erhöht so den Durchsatz und die Produktivität.

Tabelle 8 fasst die Vorteile der Verwendung der CC für die oben besprochenen Applikationen zusammen und hebt andere Applikationsbereiche der Trennung von Enantiomeren, Stellungsisomeren und Strukturanaloga hervor.

Orthogonalität

Orthogonale Trennmodi sind einander komplementär, jedoch in ihrer Art und Weise, wie Peaks unterschiedlich reteniert werden, einzigartig. Dadurch erzeugen sie mehr Informationen über eine Probe als ein einzelner Trennmodus allein. Die Fähigkeit, Analyten mithilfe verschiedener Techniken aufzulösen, ist aus folgenden Gründen äußerst wichtig:

• Das Vertrauen, dass eine Verunreinigung, ein Abbauprodukt oder eine ähnliche Verbindung (z. B. isobare Verbindungen oder koeluierende Verbindungen) identifiziert und charakterisiert werden können
• Sicherstellen der vollständigen Charakterisierung einer Probe
• Möglichkeit, mehr Informationen über eine Probe zu erhalten
• Abtrennung gewünschter Verbindungen von Matrix-Interferenzen

Beispiele orthogonaler Trenntechniken umfassen komplementäre Modi wie Normalphasen- und Reversed-Phase-Chromatographie. Die CC-Selektivität ähnelt der Normalphasen-Chromatographie, aber sie ist viel robuster, zuverlässiger (siehe Kapitel 2) und reproduzierbarer als jede Normalphasenmethode. Der folgende Abschnitt zeigt Beispiele, wie die CC als orthogonaler Trennmodus verwendet wird, um die oben aufgeführten Ziele zu erreichen.

Die Trennung eines pharmazeutischen Wirkstoffs (Metoclopramid) von seinen verwandten Substanzen mithilfe der ACQUITY UPLC und ACQUITY UPC² Systeme zeigt diese Orthogonalität (Abbildung 53). Peaks, die mit der einen Methode nicht aufgelöst werden, werden mit der anderen Methode aufgelöst und umgekehrt. Die CC ist in der Lage, polare Verbindungen länger als die RP-LC zu retenieren (z. B. Peaks 1 und 2). In diesem Beispiel löst das ACQUITY UPC² System die kritischen Paare (Peak 5 und Metoclopramid) auf und erleichtert so in größerem Umfang die Aufreinigung und Trennung unbekannter Verbindungen zur anschließenden Identifizierung und Charakterisierung. All dies macht die CC zu einer idealen Technik, die parallel mit anderen Routinetechniken eingesetzt werden kann, um eine Vielzahl von Aufgaben zu Trennungen zu lösen.

Orthogonale Methoden sind auch wichtig, um nachzuweisende Analyten von Matrixstörungen zu trennen, z. B. in der Bioanalyse oder Lebensmittelanalyse.

Abbildung 54A zeigt ein typisches Beispiel für ein LC-MS/MS-Chromatogramm von Clopidogrel, das mithilfe von Proteinfällung aus menschlichem Plasma extrahiert wurde. Aufgrund der Hydrophobizität von Clopidogrel wird es während der Analyse relativ spät eluiert. Störende Phospholipide (mit einer cholinhaltigen Kopfgruppe) eluieren ebenfalls in derselben Region (Abbildung 54B), was möglicherweise eine Ionensuppression des Clopidogrel-Peaks und eine variable Quantifizierung verursacht. Interessanterweise eluieren die störenden Phospholipide auf dem ACQUITY UPC² System in etwa derselben Region (Abbildung 54C). Aufgrund der Orthogonalität der CC in Bezug auf die Reversed-Phase LC eluiert der nachzuweisende Analyt viel früher und weg von diesen störenden Phospholipiden (Abbildung 54D). Dies minimiert die Wahrscheinlichkeit von Matrixeffekten und gewährleistet eine genauere Quantifizierung.

Diese Vorteile veranschaulichen alle die drei Hauptmerkmale der CC, die zuvor in diesem Kapitel erwähnt wurden:

1. Convergence-Chromatographie vereinfacht den Workflow
2. Convergence-Chromatographie trennt Verbindungen mit ähnlicher Struktur
3. Die Convergence-Chromatographie ist orthogonal zur Reversed-Phase LC

• Kombiniert mehrere Techniken in einer
• Reduziert den Zeitbedarf für Probenvorbereitung und Analysen
• Kann zur direkten Injektion von organischen Lösungsmitteln/Extrakten verwendet werden

• Enantiomere (chiral)
• Positionsisomere
• Strukturanaloga und Konjugate

• Mehr Sicherheit bei der Identifizierung von Verunreinigungen/Abbaumitteln
• Vollständige Probencharakterisierung
• Trennung von Analyten von Matrixstörungen