小颗粒填料的应用前景
分离度和柱内谱带展宽之间的关系
如果我们以基本常识考虑色谱分离度，那么需要考察两峰的宽度，与峰之间距离[tR,2 – tR,1]的比值。如果我们能够将峰变更窄或能进一步分离，我们将能够提高分离度。
图14：基本的分离度等式。[N]为塔板数，[α]为选择系数和[k]为保留因子。
把多个相关项，以基本分离度等式的形式，数学表示出分离度。分离度表达式，包括影响色谱分离度的物理和化学参数；塔板数[N]，选择因子[α]和保留因子[k]。选择因子和保留因子是化学因子，历来是比较容易操控，以提高分离度。这些参数受到，诸如温度、洗脱液、流动相组成和色谱柱的化学性质等因素的影响。塔板数是物理性参数[机械方面]，由于该参数的平方根对分离度存在影响，因此较难操控。但是，如果颗粒大小非常小，塔板数对分离度将有显著的影响。UPLC技术专注于，利用2 μm以下颗粒，提高分离度，从而提高系统效率。
如果我们能够弄清这三个参数怎样表征色谱分离，那么就可以很容易地理解这些参数如何影响分离度[图15]。保留因子[k]和选择因子[α]是移动色谱峰的化学因素，彼此相关，能够度量被测物与固定相和流动相之间的相互作用。我们能通过提高k来改善分离度。但是，这样会导致分离结果的保留时间延长，灵敏度降低，并且峰宽加宽。A的增加引起分离度加大，相似时间内，峰洗脱顺序相同，或出现洗脱顺序的改变。在分离中，塔板数[N]是谱带展宽的物理度量指标。假定通过减少填料的颗粒大小，改善N值，峰的中心距不会改变。另外，颗粒大小的减小将使色谱峰更窄、效率更高，从而能提高分离度和灵敏度。
图15：单独的化学和机械因素对分辨率的影响。
分离度、效率和颗粒大小之间的关系
UPLC技术通过最小化色谱仪的谱带展宽、使用较高塔板数和较小颗粒的色谱柱[1.7 μm – 1.8 μm]，使分离度的物理[机械]影响因素最大化。通过简单的色谱示例和基本的算术运算，能够更好的理解UPLC技术蕴含的色谱原理。
如基本的分离度等式所述，分离度直接与效率的平方根成比例。
图16：分离度[Rs]直接与效率[N]的平方根成比例。
另外，塔板数与颗粒大小成反比。这意味着，如果填料的颗粒大小减小，分离效率将增加。例如，如果填料颗粒大小从5 μm减小到1.7 μm[3x]，理论塔板数应当增加3x，结果分离度增加了1.7x[3的平方根]。
图17：在柱长恒定时，塔板数[N]反比与颗粒大小[dp]。
为了取得理论预计的塔板数和分离度，必须采用颗粒大小对应的最佳流速。最佳的流速[Fopt]反比于颗粒大小。这就意味着，如果颗粒大小从5 μm减少到1.7 μm [3x]，那么颗粒运行的最佳流速将增加3x，并能使分析时间同程度的减少[3x]，因此将增加样品的通量。
图18：对恒定的柱长，流速[Fopt]反比颗粒大小[dp]，将引起分析时间[T]随颗粒大小同比例减小。
作为色谱工作人员，当色谱流速改变时，我们观察的首要事情之一是，将会发生什么。如果增加流速，分析时间减少。另外，峰宽也会减少。当峰宽变窄，峰高成比例的增加。更高更窄的峰容易检测，容易与基线噪音区分[更高的S/N]，灵敏度更高。
图19：更窄的峰宽能得到更高的柱效和峰高。塔板数[N]与峰宽[w]的平方成反比。进而，当峰宽减少时，峰高成比例的增加。
应用色谱的这些理论原理。如图20，在ACQUITY UPLC色谱仪中，当柱外谱带展宽最小化时，将得到色谱柱的理论效能。
图20：理论与实际的比较。在两根相同规格[2.1 x 50 mm]的色谱柱上，进行色谱分离操作。在两色谱分离中，除了流速外，采用相同的色谱条件。速度按颗粒大小，成比例选取。
上面所讨论的内容表明柱内谱带展宽的重要性。如果能进一步理解，那些工艺流程影响谱带展宽，怎样减少谱带展宽，那么能够实现效率和分离度的提高。
对范第姆特曲线的理解
如以前所述，峰宽可认为是被测分子的统计分布[方差，σ2]。峰宽与峰走过的距离，成比例线性增加。峰宽和峰所走过的距离之间的关系是一个概念，被称为与理论塔板高度[HETP或H]。H来源于蒸馏理论，是柱效应的度量指标，需要考虑几种谱带扩展的相关过程。将这放入较熟悉的项中，HETP越小，色谱柱中的塔板[N]数越多[图21]。
图21：确定HETP的简化等式。[L]为柱长，[N]为塔板数，[HETP]理论塔板高度。
如果我们能够弄清楚柱内分子水平上出现的情形[被测分子怎样与流动相和固定相相互作用]，我们就能近一步理解发生的不同相关扩散的过程，这些过程影响了色谱性能[图22]。
有几个同时发生的相关扩散过程：
- 被测分子被运送到颗粒表面和颗粒周围 [涡流扩散]
- 被测分子在大体积流动相中前后扩散[纵向扩散]
- 被测分子扩散进出色谱孔 [质量传递]。
图22：发生在柱中的相关扩散过程。
这些相关的扩散过程能够用范第姆特方程式数学表达。
图23：范第姆特方程式。
范第姆特方程式由3项组成：
- A项[涡流扩散]主要与填料的颗粒大小相关。其取值也与色谱床装填的好坏程度决定。与颗粒上和颗粒周围流动的一致性或不一致性相关。
- B项[纵向扩散]与大量流动相中和固定相上被测物的扩散相关，随流动相速度的增加而减小[线性速度]。
- C项[质量传递]与线速度[流动相的速度]和颗粒大小的平方相关。质量传递是被测物分子与固定相内表面和扩散进出填料孔距离的相互作用。
通过一定比例的HETP与流动相线流速[u]的对比图，制图得到3个参数项，这样我们就能独立得到这些项[图24]。
图24：范第姆特方程式的各个虚线项。
A项为水平线。该项与颗粒大小，色谱柱的装填情况相关，与色谱柱线速度[流动相速度]的不相关。当填料的颗粒大小减少时，H值也减小[更高的效率]。
B项是随线速度增加趋势向下的曲线。该项不依赖颗粒大小，它表示如果流动相以较慢的线速度移动，被测物分子将在色谱柱中停留更长的时间，因此，在色谱柱中存在，谱带纵向展宽[扩散]的可能性更大。相反的，如果流动相以更快的线速度移动，扩散时间更短，这样很少有谱带展宽现象发生。
C项在H和u之间是线性增加的关系。在分子分布中，一些分子进入了固定相的小孔，其它分子则保留在移动的流动相中，直到遇到其它的固定相颗粒。随后发生相反的过程，被固定的分子脱离固定相，进一步向色谱床的下端移动。分子进出固定相的小孔，需要花费时间，因此，当分子从一个固定相颗粒转移到下一个颗粒时，含有吸附分子的被测物谱带在色谱柱中移动时将会变宽。固定相颗粒越小，这一过程发生越快，将阻止被测物谱带的展宽。如果流动相移动快速，那么在固定吸附分子与前面移动的分子之间将出现较大的距离。这表明为了整个被测物分子能够保持一起移动，流动相应当以较慢的线速度移动。当流动相的速度增加时，整个被测物分子将更加分散，结果带扩展加大。
将A、B和C项整合在一起，得到范第姆特曲线[图25]。以曲线最低点对应的线速度进行分离操作，将得到最高的效率和色谱分离度。
如果我们将这个与图23中的范第姆特方程相关联，如果颗粒大小减少一半，那么H将减少2倍。因此，使用更小颗粒的填料，可能减少色谱柱中的谱带展宽。
图25：将范第姆特方程的3个独立项整合在一起得到范第姆特曲线。
图26：10 μm和5 μm颗粒的范第姆特图线比较。
例如，图26描述了10 μm和5 μm颗粒的范第姆特图线。在图线上能够发现，要得到最低的H值，10 μm颗粒的线速度的最佳操作范围非常窄[18 μm @ 0.7 mm/sec]。如果流动相的速度过慢或过快，将会增加H[效率损失]，进而降低色谱分离和灵敏度。而5 μm的颗粒在较高的流动相速度下有较低的H值[10 μm @ 0.95 mm/秒；较高的效率]。
同时有较大的线速度范围，能得到H值。这意味着，与10 μm颗粒装填的色谱柱相比，能以较短的时间得到较高的效率和分离度。为了进一步理解这一效应，我们进一步考察颗粒大小对范第姆特方程的各独立项的影响。
因为颗粒大小与A项相关[涡流扩散]，所以颗粒大小对被测物带有显著的影响。当减小颗粒大小时，被测物分子从流动相向颗粒表面和颗粒周围转移的路径所需时间更少。较大颗粒将使被测分子移动的路径更长、更曲折。路径的不同使被测物分子的迁移时间不同，被测物谱带变宽，影响色谱峰宽。因为装填的颗粒大小变小，被测物分子路径在长度上更加类似。这使得被测物谱带更窄，相应的峰变窄，效率更高，灵敏度更高[图 27]。
图27：颗粒大小对A项的影响。
纵向扩散B项不直接受颗粒大小影响。但是，当颗粒大小减小时，范第姆特等式中的其它参数—A和C项将变小。结果，最佳的线速度[流动相速度]增加，谱带展宽减少。线速度变慢，将使被测物分子带与填料相互作用的时间延长。这意味着轴向[纵向]扩散进入流动相，需要更多的时间，结果被测物谱带展宽，扩散更厉害。线速度更高，整个被测物分子将在较短时间内通过色谱柱，这样被测物带将保持集中，由于纵向扩散时间短，峰更窄、效率更高。[图28]。
图28：线速度对纵向扩散，B项的影响。
C项受到线速度和颗粒大小的影响。整个被测物分子从流动相向颗粒表面转移。然后被测物分子通过固定相小孔的流动相到达键合表面层(如，C18，C8等），与键合相相互作用，然后走出固定相小孔，进入主体流动相。但是，被测物分子进出小孔的程度不同。这意味着，当分子返回到主体流动相时，每个被测分子经过的路径长度不同，这样导致被测物谱带[图 29]的展宽[加宽]。谱带展宽的程度取决于流动相的速度[图 30]。
图 29：质量传递[扩散]进出色谱孔。
图 30：线速度对质量传递和被测物谱带的影响[同样的颗粒大小]。
高线速度时，分子与颗粒表面的相互作用和通过流动相传递之间的时间变长。流动相的速度越快，被测物将更快地通过色谱柱，结果被测谱带变宽，更分散。这样色谱峰更宽，灵敏度更低。
流速慢时，与表面相互作用的长度变短。这样使得被测物谱带更加集中，得到更窄、更高效的色谱峰。
由于质量传递与颗粒直径成平方[dp2]关系，因此当颗粒大小降低时，质量传递显著的提高。被测物分子进入到小孔，与色谱表面的相互作用，然后脱离返回进入流动相，用的时间减少。因此，在较小颗粒色谱柱中，分离的被测物分子扩散得更快，结果色谱带更尖、更窄、更高效[图31]。
图 31：颗粒大小产生的质量传递差异[100 Å的小孔] 。更小的颗粒形成较小的被测物带。
降低颗粒大小将提高质量传递，因此能有效的减小C项斜率，这引导我们开发出现今的UPLC技术。如图22的范第姆特图线所示，1.7 μm颗粒比3.5 μm颗粒，HETP值降低了2-3x。另外，较低的H值，具有较高的线速度和较广的速度范围。这意味着选用较小的颗粒，质量传递能显著的提高，将得到更高的效率和分离度。这也意味着能增加线速度范围，以提高性能。能以较快的线速度实施分离操作，从而提高分析速度，并且不会影响分离度。
图 32：不同颗粒大小的范第姆特图线比较。
柱外效应[色谱仪]谱带展宽对范第姆特图的影响
当UPLC技术在色谱实验室中蓬勃发展和普及时，相对于现有的HPLC颗粒大小，范第姆特图已经成为衡量亚2 μm颗粒性能的流行方法。如果这些比较测量法没能在仪器设备上实施，那么可能得到错误的结论。这里提到的仪器设备是指能使柱外谱带扩展最小化。
为了说明柱外谱带展宽对性能测定的重要性，在常规HPLC色谱仪[带扩展=7.2 μL]上绘制出范第姆特图线，对1.7 μm和2.5 μm的颗粒进行了比较[图33]。两根色谱柱的颗粒物质和化学键合相是相同的。由范第姆特图线推断，这两根色谱柱的性能没有明显的不同。这怎么可能？
在这种情况下，HPLC色谱仪的谱带展宽，使颗粒1.7 μm UPLC色谱柱，与2.5 μm HPLC色谱柱，具有相似的性能测定结果。相比较大颗粒装填的色谱柱[如2.5 μm]，柱外谱带展宽大大影响了1.7 μm颗粒UPLC柱较小的峰宽，因此得到令人误解的结果。
图33：在HPLC色谱仪上3 μm以下颗粒色谱柱的比较，结果具有类似的色谱性能和线速度。由XBridge HPLC C18 2.1 x 50 mm，2.5 μm 柱和 ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 x 50 mm，1.7 μm柱，得到二氢苊的范第姆特曲线。
然后，在ACQUITY UPLC色谱仪上进行了相同的试验[谱带展宽 = 2.8 μL]。与HPLC色谱仪相比，ACQUITY UPLC色谱仪系统体积大约低84%，谱带展宽大约低60%。
如图34所示，当在ACQUITY UPLC色谱仪上操作时，这两种色谱柱的性能存在显著的不同。除了实测HETP的差异外，最佳线流速从3.0 mm/秒[2.5 μm颗粒]到10.0 mm/秒[1.7 μm 颗粒]，表明UPLC技术具有较低HETP[更高的效率]和更快的线速度[通量]。
图34：在ACQUITY UPLC色谱仪上对3 μm以下颗粒的比较，结果随着颗粒大小的减少，性能和线速度范围得到提高。在XBridge HPLC C18 2.1 x 50 mm，2.5 μm柱和ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 x 50 mm，1.7 μm柱，二氢苊的范第姆特曲线。
完全维持分离的完整性
既然已经基本了解了柱外和柱内谱带展宽的作用，那么我们就能按更加实际的方式，讲述相关项[HETP与线速度的比较]的测量：塔板数与流速的比较。
正如以前讨论的，线速度是流动相流经色谱柱的速度。线速度为一术语，用于标准化流动相的流速，独立于柱ID，这样，不同尺寸色谱柱的性能就能测量比较。最佳的线速度直接与最佳流速相关[图35]。常规的HPLC柱，仅能在狭窄流速范围内操作，实现最佳性能。如果在这一范围外使用，可能会降低性能。
图35：与最佳流速对应的最佳线速度，以获得最高效能。计算数值针对2.1 mm IDx50 mm 长，填料为1.7 μm 颗粒的色谱柱。
对于常规HPLC来说，减少分析时间[提高通量]的常规方式是简单地增加流速。对于较大颗粒的色谱柱，增大流速通常引起效率的巨大损失，进而影响分离度，因为操作在HPLC颗粒最佳线流速之上[压缩色谱分析]。在色谱性能和HPLC相关的分析速度之间需要平衡选择[图39]。
图36：HPLC中，必须在分离度和速度之间做出选择。在这种情况下，分离度将有30%的损失。
UPLC技术不用进行平衡选择。分析时间减少不影响性能。当颗粒大小从3.5 μm减小到1.7 μm，效率增加[图37]。这是由于1.7 μm颗粒UPLC色谱柱分离的色谱带窄，在这类色谱柱中柱内谱带展宽可以忽略。另外，在较高流速时将增加效率[图37]。这意味着，对于相同的色谱柱长，在较短的分析时间内能显著增加效率和分离度。
图37：颗粒大小对最佳流速的依赖性。
对柱分辨能力的理解 [L/dp]
当进行色谱分离时，首要的目标是将一种组分与其它组分分离，用于测量某一或所有组分。色谱柱的最大分辨能力，可通过柱长[L]与颗粒大小[dp]的商来估算。当在特定应用中，可能必须确定填料的颗粒尺寸以及柱长时，L/dp比值相当有用[图38]。
图 38：计算所得的L/dp比率。
这一比率也能作为一种颗粒大小向另一种颗粒大小的转换工具。L/dp比率为30000的色谱柱[具有一定难度的分离]是一非常常见的选择。如图39所示，典型的HPLC色谱柱分辨能力为30000，有150 mm长，采用5 μm颗粒装填。当颗粒大小降低时，采用较短的色谱柱，能够获得相同的分辨能力[这意味着分析时间更快；例如一根50 mm长的色谱柱，采用1.7 μm颗粒装填，L/dp的比率为30000]。除了缩短柱长之外，当颗粒大小减小时，最佳流速增加，进一步减少了分析时间。
图39：L/dp 比值的比较，将其作为分离指数[从简单到极端困难]。L/dp 比率相同的色谱柱具有相同的分辨能力。
色谱分析能够清楚的说明这一点[图40]。一根50 mm长的UPLC色谱柱，1.7 μm颗粒装填，与150 mm长、填料为5 μm颗粒的HPLC色谱柱，具有相同的分辨能力。保持L/dp比值恒定，分析时间缩短10，同时维持相同分离度。流速与每个颗粒大小，成反比例调整。进样体积与柱体积成比例调整，这样以来色谱柱载入质量相同。
图40：保持L/dp恒定的同时减小颗粒大小，能加快分离，进而维持分离的不变。
了解色谱柱长与颗粒大小比值[L/dp]的作用是理解UPLC技术的关键点。UPLC技术基于将微小、耐压颗粒，高效装填到短[高通量]或长[高分离度]的色谱柱中。这些UPLC色谱柱用于LC色谱仪，设计的色谱仪操作运行在最佳线速度下[和压力]，因为颗粒具有最小的谱带展宽。
梯度分离性能的测定 [峰容量]
在等度条件下，塔板数[N]用于测量色谱仪和色谱柱对谱带展宽的累计影响。由于与谱带展宽相关的扩散存在，被测物带的宽度将增加，被测物保留在固定相中的时间也将延长。
在梯度运行时，流动相的洗脱强度随分析过程改变。这使较强保留的被测物谱带，更快地通过色谱柱[从而改变保留时间]，这样被分离的谱带更加集中[窄]。在反相色谱中，流动相的洗脱强度增加，限制了谱带的宽度，当被分离的谱带通过检测器时，形成相似的峰。因为随着流动相强度的改变，峰宽和保留时间也将发生改变，所以塔板数[由于存在与峰宽之间的关系]不是梯度分离有效的测量法。
梯度分析的分辨性能[分离]能通过峰容量[Pc]计算。峰容量是在给定的梯度时间内能够分离的峰理论数量。峰容量与峰宽成反比关系。因此，当Pc增加时，峰宽必定减小。
图41：峰容量 [Pc] 方程式，[tg]为梯度时间 ，[w] 为平均峰宽。
图42：应用峰容量方程实现快速分离，在此0.37分钟是梯度持续时间，0.01分钟是平均峰宽，峰容积结果为38。测量的是13.4%峰高处的峰宽 [4σ]。
使用UPLC技术能显著增加峰容量。高分辨率的UPLC技术，通过在分散非常低的仪器设备上[带扩散为2.8 μL]，使用颗粒亚2 μm颗粒的色谱柱，在单位时间内，能够获取更多的信息。这样，对指定的样品可获取更多的信息。例如，磷酸化酶b的胰蛋白酶消化，使用5 μm颗粒装填的HPLC色谱柱，大约得到70个相同的峰[图43A]。使用UPLC技术，可鉴别峰数从70增加到168，提高了蛋白质鉴别的能力[图43B]。
图43：HPLC与UPLC技术峰容积的比较。
