质量准确性和分辨率

高质量准确性和低分辨率

对于高质量准确性的测量，低分辨率的四极杆质谱仪表现性能良好，比如将其应用到蛋白质的分析中：当同位素峰相对彼此，没有被分辨出时，蛋白质的质量通常定义为"平均"值。平均质量是分子中所有同位素离子的加权平均值。通常使用在四极杆质谱仪上的仪器分辨率扩大分辨响应，对10kDa的蛋白，乘以1.27的因子。所乘因子随质量数增加而显著增加（例如，100kDa乘以2.65）。不过，减小峰宽到m/z0.25（增加分辨率到4000），而不是将质谱仪分辨率限制到1000，即使用峰宽m/z0.6，能显著提高信号强度。实际工作中，大分子的ESI-MS分析能得到多电荷离子。因此，峰宽需要除以离子的电荷数，以得到在该质荷比的峰宽。

例如，带有10或20个电荷的20kDa蛋白质将产生一个多同位素离子共存峰，在m/z大约为2000或1000，各自对应的峰宽为0.9或0.45m/z单位。当这些离子在质谱仪上实测时，将分辨率设置得非常低，显著低于分辨同位素所要求的分辨率（分辨率低于10000），对每个带电状态，将得到单一的峰。由单一同位素峰峰宽的理论值除以离子所带电荷数的值，结合质谱仪峰宽，确定总峰宽。由相同m/z值的低分子量化合物的第一个同位素峰来确定，并将其作为多带电蛋白质的峰。

我们需要多大的质量准确性？能否实现，折中方案是什么？

考虑美国质谱学会杂志作者指南中明确表征的要求（2004年3月）。对只含有C、H、O、N的化合物（C0-100，H3-74，O0-4和N0-4），在整数质荷比为118，响应误差不超过34ppm时即可明确确定其化学组成，而在整数质荷比为750时，响应准确性需好于0.018ppm，以消除"所有外部的可能性"。

图15：对于化合物的明确鉴定，增加质量准确性的效益。（Quenzer，T.L., Robinson，J.M., Bolanios，B., Milgram. E. 和Greig, M.J.（作者），使用FTICR质谱进行自动准确的质量分
析，关于质谱和相关主题的50周年会议论文，Orlando, FL, 2002）.

图16：对指定结果，在数据分析中增加过滤提条件或限制误差，降低可能的候选物数量。

仪器间精确度的比较：毫质量单位[mmu]，测量误差[ppm]和分辨率

按照VIMMS计划的准确质量最佳实践指南（为起始计划，构成了部分英国测量体系），准确质量测定的绝大多数仪器要求能够实现10ppm或更佳的精确度。准确度在2mmu之内的现代质谱仪，对计算质量为118Da的物质进行测量，结果出现17ppm的误差，按照今天的标准，明确确定化学物质的分子式，这一误差已经能满足要求：
计算得到的单同位素准确质量 = 118 Da
测量的准确质量 = 118.002 Da
偏差 = 0.002 mmu
误差[偏差/准确质量x106] = 17 ppm

一台质谱仪对750m/z产生响应，准确度也为2mmu，误差将达到2.7ppm。在第一种情况下，按照美国质谱学会杂志的发行标准，对化合物分子式的明确鉴别，测量已经足够。但是对后一种情况，测量不够精确。只有最高效的傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR），对较高的质量，实现这样的精确度。一种评定仪器质量准确测量能力（类似于预期使用）的综合方法，通过均方根或均方根误差测量（RMS）误差计算。从商业化的TOF质谱仪的质量测量准确要求中选取了下列内容，说明它怎样使用。

"在通常工作条件下，仪器的质量测量准确性，在指定的m/z范围内，将好于指定ppm RMS，这是基于被测物峰（属于指定m/z）大量连续重复测量并选择适合的参照峰（属于指定的m/z）得出的结论。被测物和参照峰必须有足够的强度，不受其它物质的干扰。

有一些关键点和假设需要考虑：
1. 按照校正标准，已经用已知质量的峰对仪器进行了校正。参照峰被用于解释仪器随时间校正中出现的任何改变，并使用被测物峰确定质量测定的准确性。
2. 正常的工作条件也包括在色谱条件的细节（LC/MS性能的说明）与任何相关的MS工作条件（例如，质量分辨率、目标m/z或质谱采集速率）。
3. 强度足够假定离子数，对考查中的质谱仪（质量测定）准确性和精确性的表征不造成有害的影响。离子过少不利于离子的统计，离子过多会引起检测器饱和，这两者一起作用，将引起重复测量的标准偏差出现更大的改变，将反向影响RMS误差的计算（也与仪器校正相关）。
4. 无干扰-假定已知质量峰的质量测定不受相同或相似离子的干扰。重叠峰造成质量测定的准确性较差，这也不利于质谱仪准确性或精确性的正确表征（也与质谱仪的校正相关）。
5. 参照是m/z范围的好的表示法，这与特定样品类型的分析相关。使用下列关系式，计算RMS误差，在此Eppm是ppm误差，n是考察质量的数量:

RMS误差不允许一些测定落在ppm误差的"目标窗"之外（例如，5ppmRMS）。为了确保测定的质量，对大量重复进样，以上描述的条件需要得到满足（尤其关于强度和干扰物的影响-在图谱中具有清楚的峰轮廓的平衡离子统计）。您所见的报告的很多分辨率和质量准确性的数值不是RMS误差值，而是来自单个选定（适合的）的离子。记住这一点很重要，在所有的应用中，弱信号产生不好的离子统计数据，因此是不能用的。过强的信号同样不适合使用，造成检测器饱和。理想的平衡离子统计数据，在图谱中具有清晰度，这是分析的目标。一些比较：

关于图17：
- 四极杆分辨率不能完全区分两种化合物。
- 分辨力大约为5000，TOF数据清楚地显示两明确的峰，能够准确的进行质量测量，误差小于5ppm。

在准确质量数的精确度中，通过质量定义的改变、提高的分辨率和诸如峰形和校正需求等因素理解各种内部的相互作用，这一点很重要。如果不能清楚地理解这些，没有考虑到质量的误分配，那么将会出现其它意想不到的结果。

图17：重叠图谱表明四极f杆和TOF产生的响应，在TOF数据中两种质量值处于1mDa的准确质量范围之内。在图中，不同组分的两种碎片来自相同的被测物，并且同时处于离子源。对这种情况，采用最佳的色谱法也不起作用，因此需强调一点，较高的分辨率是有用的，尤其对未知分子的分析。这同样完全适合于QTOF产物离子数据与三重四极杆产物离子数据之间的比较。较高分辨率的另外的一个好处是，允许含氧和含烷基被测物的提取离子电流（XIC）图从总色谱图选择性地被提取而区分，四极杆数据由于分辨率低，做不到这一点.