Manuel d’introduction à la SFC préparative

Considérations relatives à la méthode analytique

Lorsqu’une méthode analytique va être mise à l’échelle à des fins de purification, il est important que la chromatographie soit la meilleure possible pour l’application. Une meilleure résolution à l’échelle analytique signifie une meilleure chromatographie à l’échelle préparative, ce qui permet d’obtenir un rendement plus élevé et des fractions plus pures. Les méthodes analytiques doivent également prendre en compte les conditions de la technique préparative, telles que le chauffage de la colonne, le mode d’injection, les chutes de pression, la pression du système et les colonnes correspondantes. Si la purification se fait par MS, le criblage et le développement de méthodes à l’échelle analytique doivent également être effectués par détection de masse. Pour les méthodes à gradient, la pente du gradient et le temps d'équilibrage doivent tenir compte de la différence de volumes entre les systèmes analytique et préparatif. L’effet du diluant doit également être pris en compte, car la charge analytique est souvent effectuée à l’aide d’injections de flux mixte, tandis que la méthode préparative requiert des injections de flux de modificateur.

Chargement

En gardant à l’esprit les différences de stratégies d’injection, les études de chargement sont généralement effectuées en premier lieu selon la plus petite échelle (analytique). Il est important de connaître la solubilité des composés dans un échantillon avant de l'introduire dans le système. La meilleure pratique pour les applications préparatives consiste à pouvoir charger le plus grande quantité d’échantillon dans la moindre quantité de solvant (échantillons hautement concentrés). Cependant, l’échantillon doit également rester dans la solution après avoir été introduit dans la phase mobile combinée de CO₂ et organique. Une fois qu'une concentration acceptable a été déterminée, une étude de chargement de l'échantillon est réalisée, dans laquelle le volume d'injection est augmenté progressivement jusqu'à ce que la résolution soit perdue, ou que la chromatographie ne soit plus utilisable pour l'obtention de fractions pures des composés cibles.

Exigences générales pour une mise à l’échelle réussie

Une fois qu’une méthode acceptable a été développée et qu’une étude de chargement a été réalisée à l’échelle analytique, l’idéal est que la rétention et la sélectivité soient identiques (ou similaires) lors de la mise à l’échelle. Pour réussir la mise à l’échelle de la chromatographie, plusieurs paramètres doivent rester constants :

■ Les phases mobiles doivent être identiques. En SFC, cela signifie qu'un cosolvant (solvant B) est identique et que le CO₂ doit être de qualité, de pression d'entrée, d'état physique (liquide ou gaz) et de méthode de distribution similaires.

■ Les colonnes doivent avoir la même chimie, longueur et granulométrie, pour permettre une correspondance chromatographique optimale à différentes échelles. Si des colonnes de faible granulométrie sont utilisées à l'échelle analytique, le rapport de la longueur sur la granulométrie (L/dp) doit donc être le même d'une colonne à l'autre.

■ Les échantillons doivent avoir la même concentration et avoir dissous le même diluant.

Transposition géométrique

En Prep SFC comme en LC, les volumes d’injection (chargement) et les débits sont mis à l’échelle géométriquement.

Pour conserver la forme des pics et la capacité de chargement, le volume d'injection doit être adapté à la taille de la colonne. La capacité est déterminée par l’équation suivante :

Soit Vol le volume d’injection (µL), D le diamètre intérieur de la colonne (mm) et L la longueur de la colonne (mm).

De même, pour maintenir la qualité de la séparation, le débit est mis à l'échelle en fonction des dimensions de la colonne. Pour des colonnes de longueur et de granulométrie identiques, la transposition géométrique du débit est la suivante :

Soit F le débit (mL/min) et D le diamètre intérieur de la colonne (mm).

Volume mort et volume extra-colonne :

Lorsque les colonnes sont de longueur identique, il est nécessaire de modifier le profil du gradient de la méthode préparative en fonction du volume mort. Pour effectuer ces réglages, le volume mort doit être mesuré pour le système analytique et le système préparatif. Pour déterminer le volume mort, un composé ou un solvant qui fournit un signal UV est généralement ajouté au cosolvant et un gradient est analysé sans colonne. En fonction du délai entre le début du gradient au niveau des pompes et le changement de signal au niveau du détecteur, le volume mort peut être déterminé en multipliant le délai par le débit (Figure 25).

Il est également important de noter l’impact de tout volume extra-colonne tel que les tubulures, les vannes d’injection, la taille de la boucle, les cellules de détection du détecteur et les séparateurs, qui peut entraîner un élargissement de la bande lors de la chromatographie finale. Pour mesurer le volume extra-colonne et l’élargissement de la bande, la colonne est retirée et une injection est effectuée. Le temps entre l’injection et la détection multiplié par le débit est égal au volume extra-colonne. La forme du pic sans colonne indique tout élargissement dû au volume extra-colonne. Le système ayant été raccordé pour l’injection du flux de modificateur, l’injection a été réalisée avec un cosolvant à 100 %, de sorte que le volume a pu être déterminé avec plus de précision et sans ajout de CO₂ post-injection. Pour plus de détails sur cette procédure, consultez l’application en ligne : Calculateur de colonne préparative OBD, accessible sur le site www.waters.com.Le calculateur de colonne est un outil accessible qui facilite tous les calculs d’échelle analytique à préparative.

Considérations relatives à la densité de la phase mobile

Les règles simples de mise à l’échelle pour la LC, bien qu’applicables en SFC, ne peuvent pas être appliquées directement, car elles supposent une densité de phase mobile constante. La mise à l’échelle en SFC est plus complexe, principalement en raison de la compressibilité de la phase mobile, entraînant des variations de densité, de pression et de température dans la colonne et entre les systèmes. Les variations de ces facteurs ont un impact sur la composition et la résistance de la phase mobile. Les effets qui en résultent sur la rétention et la sélectivité rendent plus difficile le maintien du profil de séparation entre les systèmes analytiques et préparatifs.

Les variations de densité et de température ne peuvent pas être directement contrôlées, mais il est possible de faire correspondre la chromatographie à plusieurs échelles en ajustant les paramètres de méthode suivants en SFC :

■ Faire correspondre la pression moyenne (et donc de la densité moyenne) entre les systèmes. La pression moyenne est égale à la somme de la pression avant et de la contre-pression divisée par deux. Il est possible de faire correspondre les pressions en modifiant le réglage du régulateur de pression automatisé sur les instruments analytiques ou préparatifs afin de maintenir des profils de pression (densité) similaires dans toute la colonne. Il convient de noter que faire correspondre la pression moyenne ne garantit pas toujours un profil de densité correspondant, mais les profils seront plus concordants.

■ Ajustement exact de la composition de la phase mobile du dioxyde de carbone et du cosolvant. Il s’agit essentiellement d’une conversion entre systèmes des unités de mesure du débit volumique en débit massique (sur le système analytique) ou du débit massique en débit volumique (sur le système préparatif) pour obtenir des phases mobiles équivalentes.

Dans le SFC, la composition du cosolvant est le paramètre le plus important pour contrôler la rétention des pics. Par conséquent, une mise à l’échelle précise de la composition du cosolvant est essentielle pour la mise à l’échelle de la méthode. En faisant correspondre le débit massique et la composition du CO₂ et du cosolvant avec la pression et la température de sortie de la colonne, une transposition fiable d’un instrument basé sur le débit volumique à un instrument basé sur le débit massique est possible.

Exemple de mise à l’échelle

Dans cet exemple, la méthode analytique a été développée sur le système UPC² selon les paramètres suivants (tableau 6).

Afin de maintenir une longueur de colonne et une granulométrie constantes, une colonne Chiralpak IA de 21 x 150 mm contenant des particules de 5 µm a été utilisée sur le système préparatif. Le volume d'injection a été mis à l'échelle géométriquement, de sorte que l'injection de 10 µL sur le diamètre intérieur de 4,6 mm équivalait à une injection de 208 µL sur une colonne de diamètre intérieur de 21 mm. Dans ce cas, la pompe à CO₂ du système analytique était contrôlée par le débit volumique, tandis que la pompe du système préparatif était contrôlée par le débit massique. Par conséquent, le débit de CO₂ de la méthode analytique devait être converti en débit massique avant le calcul de la transposition géométrique. Pour ce faire, on utilise l'équation suivante :

■ Débit de CO₂ = 2,67 mL/min

■ Densité de CO₂ = 0,89 g/mL

■ Débit (massique) de CO₂ = débit de CO₂ x densité de CO₂

■ Débit (massique) de CO₂ = 0,89 x 2,67 = 2,38 g/min

Puisque le cosolvant se transpose normalement (mL en mL) et le débit de cosolvant était de 0,33 mL/min, le débit analytique total était de 2,70 g/min à environ 12 % de méthanol. Ce débit et ce pourcentage ont été mis à l’échelle géométriquement, entraînant un débit préparatif de 56 g/min sur la colonne de 21 x 150 mm dans des conditions de cosolvant à 12 %.

Une fois le débit et la composition déterminés, le profil de densité devait être adapté au système analytique en utilisant la même pression moyenne. La pression avant sur le système analytique était de 162 bar et la contre-pression de 120 bar (soit une chute de pression de 42 bar). La pression moyenne a donc été calculée à 141 bar. La chute de pression du système préparatif n’étant que de 24 bar, la contre-pression a dû être réglée sur 130 bar pour correspondre à la pression moyenne du système analytique. Enfin, la température a également été adaptée à 35 °C. Avec ces paramètres, la figure 26 illustre la réussite d’une mise à l’échelle de la séparation entre le système ACQUITY UPC² et le système Prep SFC. Les profils sont les mêmes, mais il y a une légère augmentation de la rétention dans le système préparatif, probablement en raison de la différence de stratégie d’injection. Une injection de flux mixte a été réalisée par le système analytique, tandis qu’une injection à flux de modificateur a été réalisée par le système préparatif.

Empilement des injections

Pour de nombreuses applications, des injections empilées sont utilisées. Les injections empilées réduisent l’intervalle entre les cycles d’injection et minimisent l’utilisation de solvant. Les injections empilées améliorent également considérablement le débit en utilisant tout l’espace chromatographique disponible pour une séparation et une purification en continu. En général, les injections sont effectuées alors qu’un échantillon déjà injecté se trouve sur (ou élue depuis) la colonne. Par conséquent, pour utiliser des injections empilées, des méthodes isocratiques sont nécessaires. Pour empiler correctement les injections, il est nécessaire de déterminer la bonne durée de cycle (ou le temps entre les injections). De plus, la durée totale de l’analyse est nécessaire pour la dernière injection de la séquence afin de garantir l’élution et la collecte de toutes les séries de pics. La figure 27 illustre la façon dont ces valeurs sont déterminées puis appliquées à un ensemble d’injections empilées. La durée du cycle représentant environ la moitié de la durée totale de l’analyse, deux injections sont effectuées avant même le début de l’élution du premier pic cible. Après la dernière injection, deux séries de pics sont éluées et collectées. Dans ce cas, l'utilisation d'injections empilées permet de diviser par deux le temps de traitement total par rapport aux analyses classiques à injection unique.

Exemple d’applications

En raison de la plage de sélectivité étendue de la SFC décrite précédemment, la technique est adaptée à une grande variété d’applications (Tableau 7).

Tableau 7. Applications de la SFC préparative par secteur de marché.

Indépendamment du secteur de marché ou de l’objectif de la purification, la Prep SFC offre :

■ une sélectivité diversifiée dans une seule plateforme facile à utiliser.

■ une gamme d'échelles chromatographiques.

■ une productivité accrue et des économies de solvants.

■ une complémentarité à la LC en phase inverse.

■ une séparation et une purification de composés à similarité structurelle.

Dans cette section, des extraits d’exemples d’applications sont présentés pour présenter différentes procédures et domaines d’application. Toutes ces applications peuvent être consultées dans leur intégralité sur le site Internet de Waters à l’adresse suivante : www.waters.com.

Purification chirale par SFC de parfums et saveurs volatils

L’un des principaux domaines d’application de la SFC est la séparation chirale. Tout comme les énantiomères des médicaments chiraux présentent des activités pharmacologiques différentes, la stéréochimie des composés aromatiques et olfactifs dicte le goût, la qualité de l’odeur et l’intensité. La purification de ces composés peut s’avérer assez difficile en raison de leur volatilité. Le SFC offre une option rapide et à basse température pour un rendement élevé des composés chiraux d’arômes et de parfums.

Ici, les énantiomères du linalol et du terpinène-4-ol ont été purifiés respectivement à partir d’huiles essentielles de lavande et d’arbre à thé, en utilisant la Prep SFC chirale à injections empilées. La figure 28 illustre la transposition des méthodes analytiques sur une colonne AD-H de 4,6 x 250 mm vers une colonne AD-H semi-préparative de 10 x 250 mm. La séparation de l’huile d’arbre à thé montre la présence des deux énantiomères terpinène-4-ol, tandis que l’huile de lavande ne contient qu’un seul des énantiomères de linalol. Les paramètres de la méthode Prep SFC sont présentés dans le tableau 8.

Les méthodes étaient isocratiques, des injections empilées ont donc été réalisées pour maximiser l’efficacité de la collecte. Selon la chromatographie, la durée du cycle était d'environ 3 minutes pour l'huile d'arbre à thé et de 2 minutes pour l'huile de lavande. La purification chirale résultante à l’aide d’injections empilées est illustrée à la figure 29, où 50 mg d’huile d’arbre à thé ont été traités en moins de 40 minutes, et 30 mg d’huile de lavande en moins de 30 minutes.

L'analyse des fractions est présentée en figure 30, où la pureté des trois fractions est supérieure à 92 %. Des études de rendement ont été réalisées en utilisant des étalons racémiques du terpinène-4-ol et du linalol, ce qui a permis d’obtenir un rendement de 70 à 80 %, un résultat notable étant donné les récupérations assez faibles généralement rapportées.

Purification achirale d’un composé pharmaceutique par déclenchement de fractions assistée par détection de masse.

Avec la purification assistée par détection UV, les pics ne peuvent pas être distingués les uns des autres par les détecteurs. De nombreux composés absorbent à la même longueur d’onde. La purification assistée par la détection de masse recueille les fractions en fonction de la masse, ce qui est un paramètre beaucoup plus spécifique car elle permet de faire la distinction entre la ou les cibles et les impuretés éventuelles. Lors de la synthèse des principes actifs, le produit final contient parfois des impuretés intermédiaires.

L’imatinib est un inhibiteur de tyrosine-kinase utilisé dans le traitement de plusieurs cancers. Ici, les produits intermédiaires et finaux de la réaction ont été purifiés pour la synthèse de l’imatinib. Pour la première étape, le mélange a été criblé en utilisant trois colonnes achirales et du méthanol avec et sans additif d’hydroxyde d’ammonium. Les résultats de ce criblage sont présentés dans la figure 31. La colonne BEH 2-EP et le méthanol avec hydroxyde d'ammonium ont été choisis comme les meilleurs paramètres de méthode pour l'optimisation et la mise à l’échelle.

Pour optimiser la séparation en vue d'une transposition, des gradients focalisés ont été développés séparément pour l'intermédiaire et le produit. La concentration du cosolvant lors de l'élution a été calculée sur la base de la pente du gradient de criblage et du temps de rétention pour chaque pic d'intérêt. L'intermédiaire élue à 14 % de cosolvant tandis que le produit élue à 29 % de cosolvant. Des gradients ciblés de 2 minutes ont été développés en fonction de ces pourcentages ; partant de 5 % plus bas et finissant 5 % plus haut.

Pour la transposition, la même chimie de colonne a été utilisée et le rapport de la longueur sur la taille des particules (L/dp) a été conservé. La colonne analytique de 3 x 50 mm avec des particules de 1,7 µm (L/dp = 29,4) a été mise à l’échelle pour la colonne préparative de 19 x 150 mm avec des particules de 5 µm (L/dp = 30). La chromatographie mise à l’échelle (ciblée ) et la collecte assistée par la détection de masse sont présentées sur la figure 32.