粒徑篩析層析初學者指南

為了對所洗脫聚合物的每個滯留時間切片分配分子量，必須校正系統，或者更具體地說，校正管柱組。執行這個過程有多種方法，最簡單的方法是以一組表徵分析得當且分子量分布範圍盡可能窄的聚合物標準品執行相對校正。理想情況是使用一組單分散標準品，亦即分子量單一且重均和數均分子量之比（分散性）等於1 (Mw/Mn = 1)。

最接近這種情況的方法是使用專門為此目的聚合的聚合物標準品，例如陰離子聚合的聚苯乙烯窄分布標準品。標準品涵蓋了非常廣泛的分子量範圍（從單體到分子量>10,000,000的聚合物），且分散性<1.10。對於真正視為窄分布且可用於GPC校正的校正標準品，分散性應該<1.10。還有執行寬分布標準品校正的方法，並且也可以使用Benoit通用校正程序（使用或不使用線上黏度偵測器）。我們將詳細探討每種方法：

窄分布標準品相對校正

傳統的窄分布標準品校正技術可稱為相對校正，因為得出的平均分子量是相對於校正物的。例如，如果使用聚乙烯作為樣品，並以聚苯乙烯窄分布標準品校正管柱組，那麼積分後得出的分子量將以聚苯乙烯為凖，這對於聚乙烯是不正確的。但對許多人來說卻是不錯的選擇，他們只需要將得出的不明物分子量與一組「可接受」的值比較。這些分子量值對於目標聚合物是否真的「絕對」並不重要；只要得出的這些值在可接受的範圍內即可。

其他有些窄分布標準品也可用於有機GPC分析，例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚異戊二烯、聚丁二烯、聚四氫呋喃，但聚苯乙烯無疑是用於有機GPC分析的主要窄分布標準品。在水性GPC分析中，最廣泛使用的是聚環氧乙烷，其次是用於低分子量分子的聚乙二醇，以及聚三葡萄糖（以丙糖結構為主的多醣）。運作一系列窄分布標準品後，接著執行多項式擬合（通常是三階或五階），然後用所產生的log M相對於滯留時間（或體積）繪製校正曲線。

寬分布標準品校正

也可以使用寬分布標準品來校正GPC管柱組，這種標準品與作為不明物運作的聚合物屬同一物質。寬分布標準品能夠從各種不同的供應商渠道購買，這種標準品應進行過充分的表徵分析，亦即已經透過替代方法（例如透膜滲透法、光散射法、超高速離心法）测得數均、重均、Z均和可能的黏均分子量。另一種方法是使用材料的實際「樣品」（大量存在），其中平均分子量已透過其他技術完成測定。這種做法的好處是，所用到的聚合物結構與每天分析的不明樣品相同。

將已知的平均分子量輸入軟體中，在與不明物層析分離的相同條件下，以慣用方式對寬分布標準品進行層析分離。軟體會執行單純形搜尋常式，將寬分布標準品的層析分離形狀擬合到指定的平均分子量。產生的校正曲線將含有每個平均分子量的數據點。如果只提供數均和重均分子量值，則產生的校正曲線會含有這兩個點加上峰分子量，也稱為三點校正曲線。寬分布標準品的概念是Hamielec於1969年發表的研究中提出的。建議使用兩個不同分子量的寬分布標準品，以增加校正曲線的分子量範圍。即使是使用平均分子量已知的兩個寬分布標準品，也只能得出六點校正曲線（使用搜尋常式結果中的峰分子量值）。不過對於每天運作相同聚合物的QC實驗室而言，在與寬分布標準品相同的分子量範圍內，這種校正效果非常好，可以提供絕對分子量。

其他有些窄分布標準品也可用於有機GPC分析，例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚異戊二烯、聚丁二烯、聚四氫呋喃，但聚苯乙烯無疑是用於有機GPC分析的主要窄分布標準品。在水性GPC分析中，最廣泛使用的是聚環氧乙烷，其次是用於低分子量分子的聚乙二醇，以及聚三葡萄糖（以丙糖結構為主的多醣）。運作一系列窄分布標準品後，接著執行多項式擬合（通常是三階或五階），然後用所產生的log M相對於滯留時間（或體積）繪製校正曲線。

通用校正

「通用校正」的概念是Benoit等人於1967年提出的。這種校正方法並不是將一系列窄分布標準品的分子量對數相對於滯留時間繪製曲線，而是使用特性黏度[η]與分子量M的乘積的對數相對於滯留時間繪製曲線。[η]M乘積與流體動力體積有關。Benoit發現，為各種窄分布標準品繪製出一系列流體動力學體積值，會產生一條奇異的校正曲線。換句話說，所有點都在同一條曲線上擬合。一旦建立這種「通用」校正程序，任何無規線團聚合物都能在適當的溶劑中運作，並根據通用曲線來測定分子量。Benoit使用玻璃毛細管黏度計來量測窄分布標準品和樣品的黏度。建立起通用曲線後，還可以繪製出特性黏度對數與窄分布標準品分子量對數的關係圖。此圖稱為黏度定律圖，又稱Mark-Houwink圖。此圖的斜率為alpha（有時稱為α），截距稱為log K。產生的方程式稱為Mark-Houwink方程式，如下所示：

《聚合物手冊》(Polymer Handbook)中說明了多種不同聚合物/溶劑組合的K值和alpha值。可以將這些經驗常數輸入到現今市面上許多GPC軟體套件中，得出許多聚合物的「絕對」或精確分子量。請務必確保手冊中的值對於要分析的聚合物是準確的，否則就會出現錯誤。 

如今，我們可以使用線上黏度偵測器，連同示差折射率(dRI)偵測器，直接得出每個切片的分子量。dRI是濃度(C)偵測器，黏度偵測器會提供特性黏度和濃度([η]C)的乘積。將黏度偵測器的訊號除以dRI訊號，就能得出聚合物訊號峰上每個切片的特性黏度[n i]。現在已經知道了特性黏度以及每個切片的滯留時間（或體積），可以回到通用校正曲線，得出每個切片的分子量(Mi)。這種通用校正概念的適用性相當廣泛，尤其適用於代表現今多數分析聚合物的無規線團型聚合物。其他聚合物構形，如棒狀、球形或球狀（例如蛋白質）可能不適合通用概念。使用通用校正程序時，聚合物和洗脱液或管柱填充材料之間不會發生交互作用。  

使用通用校正和線上黏度偵測器/dRI偵測器的另一個優點是，能測定出聚合物相對於已知線性聚合物標準品的分枝程度。這項技術對長鏈分枝（與短鏈分枝相反）非常靈敏，而且相較於線性聚合物，還能協助預測某種聚合物的製程情形，或最終物理性質為何，這點相當重要。 

例如，可以執行線性聚乙烯寬分布聚合物（如「NBS 1475」或任何其他已知的線性聚乙烯），產生的Mark-Houwink值由實驗測定。產生的Mark-Houwink圖（或黏度定律圖）會是線性的，斜率不變（alpha在整個分子量分布範圍內保持不變）。然後可將K值和alpha值輸入軟體中，並分析後續任何未知的聚乙烯，將產生的黏度定律圖與已知線性聚乙烯的黏度定律圖比較。

如果不明物表現出任何長鏈分枝，則黏度/分子量關係不會呈線性；亦即黏度不會隨分子量線性增加。與線性的偏差越大，長鏈分枝的程度就越高。只有在沒有長鏈分枝且斜率不變的低分子量下，分枝聚合物才能得出準確的alpha。一旦存在長鏈分枝，對於此分子量的聚合物，alpha會不斷變化（甚至可能趨近零），變得毫無意義。分枝聚合物與線性聚合物的黏度定律圖顯示了一個簡單的比率，那就是分枝指數(g')，其中：g'=[η ] br/[η] lin。可以進一步計算以測定分枝頻率、存在的分枝類型等。線上增加黏度偵測器和折射率偵測器明顯可以提供更多聚合物的相關資訊，特別是：

• 經由通用校正測得聚合物的「絕對」或精確分子量
• 計算聚合物的特性黏度
• 分枝測定

執行GPC分析

準備進行GPC分析時最重要的守則是找到合適的溶劑來溶解聚合物。雖然聽起來微不足道，但請記住，GPC是一種根據溶液中聚合物的大小進行分離的技術。聚合物鏈會在溶液中打開，變成某種鬆開的構型，而選擇的溶劑可以決定打開的大小。許多聚合物在室溫下可溶於各種溶劑，但在某些情況下（特別是對於高結晶聚合物），需要高溫才能溶解。GPC樣品製備的另一個重要層面就是所選的濃度。如果樣品在管柱組中的上樣量過高，可能會產生濃度或黏度效應，導致沖堤量不正確。另一個考慮因素是能否過濾聚合物溶液。我們將探討其中一些樣品製備的注意事項。

請注意，在許多顯示硝酸鈉的情況下，不少分析人員都會使用醋酸鹽、硫酸鹽、氯化鈉等。我們建議使用硝酸鈉，因為已經證實它可以非常穩定地減少中性和陰離子化合物的離子干擾。使用這些不同的洗脱液是因為填充材料整體陰離子電荷的關係。用於水性GPC的甲基丙烯酸酯型凝膠填料具有整體陰離子電荷，如果單獨在水中使用，可能會導致陰離子樣品出現離子排斥作用，陽離子樣品出現離子吸附作用。 

洗脱液在用於層析分離系統之前，應一律於真空下過濾。若是有機溶劑，通常會使用碳氟化合物濾膜。濾膜的孔隙大小一般為0.45 μm（微米）。對於水性GPC（水過濾），則會使用醋酸鹽類型的濾膜。如果準備進行光散射分析，最好以0.20 μm濾膜來過濾洗脱液。某些有機溶劑非常黏稠（如DMF），不能有效潤濕碳氟化合物濾膜表面。這時有一個小技巧，就是先用甲醇潤濕濾膜表面，然後快速開始DMF過濾。之後需要丟棄這個有少量甲醇/DMF的混合物，然後在濾膜變乾之前開始DMF過濾。

濃度

為分析選擇合適的溶劑之後，下一步就是製備窄分布標準品溶液和樣品溶液。請仔細使用足夠的濃度以便得出可接受的訊噪比，而不會有管柱超載和濃度效應的風險。下表是通用的「經驗法則」，可當作製備何種濃度的指南。這些濃度以百分比表示，1.0 mg/mL表示為0.10%。參數未經過溫度校正，因此假設所有溶液都在室溫下製備。請記住，如果在執行黏度測定或光散射分析，就需要確定進樣的精確質量。如果是在高溫下進行分析，就需要進行密度校正。所顯示的濃度在假設每支管柱的最大進樣量為100 μL的情況下使用。 

製備樣品

現在已經成功將標準品和樣品溶解在所選擇的溶劑中，並且安裝了GPC管柱，可以開始進樣了。接下來需要決定是否應該過濾樣品溶液。在所有情況下，幾乎都要在進樣前過濾樣品溶液。  

一般而言，與前述的溶劑過濾一樣，我們會選擇0.45 μm的碳氟化合物濾膜。在某些情況下，如果有非常細的顆粒物（如炭黑、二氧化鈦、二氧化矽或其他填料），可以使用0.20 μm濾膜。  

顯然，當我們開始使用非常細的濾膜大小時，聚合物剪切可能會成問題。以0.20 μm濾膜來過濾高分子量聚合物，肯定會導致一些剪切降解現象。因此可能不得不放棄過濾樣品，並期許不會因管線過濾器或管柱篩板堵塞而導致系統壓力增加。  顯然，當我們開始使用非常細的濾膜大小時，聚合物剪切可能會成問題。

現在可以開始進樣標準品和樣品了。如前所述，請以表中顯示的濃度，每支管柱最多進樣100 μL。在1.0 mL/min的流速下，每支管柱的運作時間約15分鐘，因此三管柱組的分析時間約為45分鐘。  顯然，當我們開始使用非常細的濾膜大小時，聚合物剪切可能會成問題。

執行樣品組後，數據處理系統就會根據指定的積分方法來處理結果並提供完整的報告。這個過程可以在Empower軟體的「執行並產生報告」模式下自動完成，或者可以選擇進入各個原始數據檔案，對每個樣品進行手動積分。