Guia para iniciantes em cromatografia de exclusão por tamanho

Quais colunas devo utilizar e por quê?

A seleção da coluna é fundamental para garantir que se obtenha a distribuição correta do peso molecular do polímero de interesse.

Fatores iniciais a serem considerados: Solubilidade

Solúvel em água:

• Linha de colunas Ultrahydrogel

Solúvel orgânico:

• Colunas de HR Styragel para trabalhos de alta resolução
• Colunas de HT Styragel para trabalhos em alta temperatura
• Colunas de HMW Styragel para polímeros de peso molecular ultra-alto

Com qual solvente devo adquirir minhas colunas preenchidas e por quê?

As colunas de HR, HT e HMW são preenchidas com:

• THF
• Tolueno
• DMF

Estão disponíveis colunas especiais preenchidas com metanol para análise à temperatura ambiente com HFIP (hexafluoroisopropanol). Se estiver utilizando um solvente diferente desses quatro para sua aplicação, há algumas regras a serem consideradas. Se estiver fazendo uma aplicação à "temperatura ambiente" em um solvente, como clorofórmio ou cloreto de metileno, converta a partir de THF. Se planeja fazer trabalhos de alta temperatura em TCB, ODCB, por exemplo, converta a partir de tolueno em aprox. 85 a 90 °C. Se for utilizar um solvente muito polar, como DMAC (Dimetilacetamida) ou NMP (n-metilpirrolidona), converta a partir de DMF.

No momento, tenho colunas no solvente “A”, mas como faço para mudar para o solvente “B”?

Geralmente, é possível alternar diretamente de um solvente para outro a 0,1–0,2 mL/minuto (consulte o manual de uso e cuidados da coluna) se os dois solventes forem miscíveis. Se os solventes não forem miscíveis, será necessário utilizar um solvente intermediário (no qual ambos os solventes são miscíveis).

Em que ordem devo colocar as colunas e por quê?

Geralmente, não importa a ordem em que as colunas são colocadas. A ordem não afetará os cálculos de distribuição de peso molecular do polímero de eluição. No entanto, é recomendável sempre colocar as colunas de 100 Å ou 50 Å no final do conjunto, pois o gel de estireno/divinilbenzeno nessas colunas tende a ser mais macio e menos durável.

Qual taxa de fluxo devo utilizar na minha coluna de GPC?

Recomenda-se não exceder 1,0 mL/min para as colunas analíticas com diâmetro interno de 7,8 mm. A resolução "ideal" para essas colunas é de aproximadamente 0,70 a 0,80 mL/min. A taxa de fluxo ideal para as colunas de diâmetro interno estreito de 4,6 mm é de 0,3 a 0,35 mL/min. Consulte o manual de uso e cuidados para obter mais detalhes.

Devo aumentar gradualmente o fluxo e a temperatura ao iniciar as colunas?

É obrigatório aumentar a taxa de fluxo para colunas analíticas de GPC, especialmente a série HR. O aumento repentino no fluxo (e subsequentemente na pressão) certamente danificará as colunas. A elevação da temperatura não é tão crítica. Geralmente, aumentamos a taxa de fluxo de 0,0 para 1,0 mL/min em um intervalo de 60 segundos, e a temperatura de ambiente para 150 °C (como exemplo) durante várias horas.

Como faço para escolher o intervalo de tamanho dos poros de minhas colunas?

O intervalo de tamanhos de poros é escolhido pela determinação do intervalo de peso molecular aproximado da amostra de interesse. Se soubermos que o intervalo de peso molecular é baixo, por exemplo, (como uma resina epóxi), um conjunto de colunas de 103, 500, 100 e talvez uma coluna de 50 Å seria utilizado. Se um PVC de peso molecular médio for a amostra de interesse, um conjunto de 103, 104 e 105 deverá ser utilizado. A escolha de tamanhos de poros individuais direcionados ao intervalo de peso molecular do polímero fornece a mais alta resolução. Se o intervalo de peso molecular não for conhecido, ou for muito amplo, será recomendável utilizar colunas de leito misto (ou seja, "linear" ou "intervalo estendido") que fornecem uma mistura de tamanhos de poros.

O que é resolução e de quanto eu preciso?

Na análise de GPC, resolução significa intervalo de peso molecular separado em um volume incremental de eluição. Gostaríamos de maximizar isso sempre que possível. A maneira mais fácil de maximizar isso é adicionar mais colunas (e, portanto, tempo de análise, infelizmente). Outra forma é utilizar um tamanho de partícula menor (aprox. 5 μm), o que aumentará a eficiência. A concessão aqui é a durabilidade e a vida útil da coluna. Em separações em que oligômeros, aditivos e distribuições multimodais estão presentes, a resolução pode ser importante. Se a amostra for um polietileno de alta densidade com uma ampla distribuição, a resolução pode não ser tão importante.

A Waters fabrica colunas no intervalo de alta resolução (série HR), que têm 5 μm, na série HT, aprox. 10 μm (ideais para trabalhos em alta temperatura e várias trocas de solvente) e na série HMW, que tem partículas de 20 μm. Elas são adequadas para amostras de peso molecular muito alto, em que a deformação é um problema, e a resolução não é tão crítica.

O que é um padrão “estreito”? O que é um padrão “amplo”?

• Padrões "estreitos" são aqueles em que a polidispersão é inferior a aprox. 1,10. A polidispersão é definida como a razão entre o peso molecular médio ponderal (Mw) e o peso molecular médio numérico (Mn).
• Padrões "amplos" têm polidispersões maiores que 1,10 e geralmente são o mesmo polímero que a amostra a ser analisada.

Se eu utilizar padrões “estreitos”, posso injetar mais de um padrão por vez?

Em GPC convencional com detecção de RI, é certamente aceitável injetar uma mistura de padrões, desde que haja resolução suficiente entre os padrões eluídos. Sugerimos um máximo de três. Com detecção avançada, como viscosimetria, em que a área sob a curva do padrão precisa ser conhecida com precisão, um padrão por vez deve ser injetado.

Que padrão(ões) devo utilizar para meu polímero?

Para a maioria das pessoas, uma calibração "relativa" padrão estreito é adequada. Nesse caso, os padrões de poliestireno são a escolha usual para GPC orgânica, mas padrões estreitos de PMMA, poli-isoprenos, polibutadienos e poli-THF podem ser utilizados. Para GPC aquosa, estão disponíveis óxidos de polietileno, polietilenoglicóis e pululanos (polissacarídeos) estreitos. Se o usuário precisar do peso molecular "verdadeiro" (em relação ao calibrador não ser bom o suficiente), o padrão amplo (ou referência) com a mesma natureza química das amostras pode ser utilizado.

Os padrões amplos são confiáveis?

Na maioria dos casos, padrões amplos que estão disponíveis no mercado foram bem caracterizados por técnicas que fornecem um Mw, Mn, Mz razoável, etc. Há uma certa confiança na aquisição desses padrões de que os valores relatados são acurados e obtidos com excelente precisão. Afinal, sua curva de calibração é baseada nesses valores. Também é possível enviar uma amostra representativa típica de amostras executadas em laboratório para análise por essas técnicas auxiliares. Muitos laboratórios e universidades prestadoras de serviços podem realizar essas análises e fornecer Mn, Mw, Mz, etc. em sua amostra que deseja utilizar como um padrão amplo.

Posso utilizar os valores k e alfa do Polymer Handbook?

O conceito de calibração universal, o desenvolvimento de uma calibração baseada no log de volume hidrodinâmico em vez de no log de peso molecular, permite obter pesos moleculares "absolutos" para desconhecidos. Um gráfico de log (viscosidade intrínseca) versus log (peso molecular) resulta no que é referido como o gráfico de "Mark-Houwink" ou "lei da viscosidade". A inclinação dessa curva é alfa, e a interceptação determina k, (as constantes de Mark-Houwink). Na ausência de um detector de viscosímetro em linha, as constantes de Mark-Houwink podem ser empregadas, desde que sejam bem conhecidas não apenas pelos padrões estreitos para desenvolver a calibração universal, mas também pelo desconhecido. Os valores encontrados no Polymer Handbook devem ser para o polímero de interesse correto, no intervalo de peso molecular correto, no solvente que está sendo utilizado e na temperatura de operação.

Como faço para preparar minha fase móvel?

Na maioria dos casos, a única etapa necessária para preparar a fase móvel é a filtração. O solvente deve ser filtrado através de um filtro de fluorocarbono de 0,45 μm (mícron) (tipo acetato para GPC aquosa).

Quais aditivos são importantes e quando devo utilizá-los?

Em certos casos, é necessário algum aditivo de fase móvel. Por exemplo, brometo de lítio 0,05 M é adicionado a solventes polares, como DMF, DMAC e NMP. Esses solventes polares são utilizados para analisar polímeros polares, como poliuretanos ou poli-imidas, e ocorre uma interação de dipolo, fazendo com que subpicos artificiais apareçam na extremidade de alto peso molecular da distribuição. Essa interação é eliminada com a adição do sal. Em análises de poliolefinas a alta temperatura, é necessário adicionar aproximadamente 1 grama por 4 litros de um antioxidante (praticamente qualquer fenol impedido funcionará) à fase móvel (TCB, por exemplo). Isso ajudará a reduzir a oxidação da amostra, pois ela fica no carrossel de amostras em alta temperatura antes da injeção.

Como faço para preparar minhas amostras? (ou seja, temperatura, tempo e mistura)

A principal pergunta que se deve fazer antes de tentar fazer uma análise de GPC é: Em que minha amostra é solúvel? A Waters começou como uma empresa de GPC, e desenvolvemos uma longa lista de solventes e temperaturas para quase todos os polímeros que já foram executados pela GPC. O tempo que a amostra leva para se dissolver (seja em temperatura ambiente ou em temperatura elevada) geralmente depende de dois fatores: o peso molecular e a cristalinidade. Quanto maior o peso molecular e mais cristalino o polímero, mais tempo ele levará para se dissolver. Normalmente, duas a três horas com uma leve agitação dissolverão a amostra. Em alguns casos (por exemplo, polietileno de altíssimo peso molecular), são necessárias várias horas. A mistura em alta velocidade, a dissolução ultrassônica e a dissolução em micro-ondas devem ser evitadas, a menos que seja realizada sem qualquer degradação do polímero.

Que concentração e volume de injeção devo usar?

Como regra geral, um polímero com um peso molecular de pico de 100000 deve ser preparado no solvente a uma concentração de aprox. 0,10 a 0,12% (peso/volume). Isso representa aproximadamente 1 a 1,2 mg de amostra (ou padrão) por mL de solvente. À medida que aumenta o peso molecular, a concentração deve diminuir em conformidade. Um polímero de alto peso molecular (como uma média ponderal de aprox. 3000000) deve ser analisado a uma concentração < 0,02% (p/v). Por outro lado, uma resina epóxi com um peso molecular abaixo de 1000 pode ser executada a uma concentração de 0,20%.

Nessas concentrações, o volume máximo de injeção por coluna de 7,8 x 30 mm não deve exceder 100 μL.

Quais as vantagens de ter um viscosímetro e/ou detector de espalhamento de luz on-line?

Como os químicos de caracterização de polímeros desejam obter mais informações sobre suas amostras específicas, mais pessoas estão se inclinando a adotar técnicas de "detecção avançada". Ter um viscosímetro on-line com o detector de índice de refração oferece três vantagens principais em relação a apenas um RI:

• Peso molecular "absoluto" via calibração universal
• Viscosidade intrínseca do polímero ao longo da distribuição
• Informações de ramificação conforme relacionadas à ramificação de cadeia longa

Com o detector de espalhamento de luz, é possível obter:

Peso molecular médio ponderal (Mw) "absoluto" sem estabelecer um raio de rotação da curva de calibração da informação de ramificação do polímero como para o viscosímetro.