ACQUITY Premier と組み合わせた BioAccord LC-MS システムを用いたオリゴヌクレオチド不純物の分析

このアプリケーションノートでは、純度分析および大幅に修飾されたオリゴヌクレオチドとその不純物のインタクト質量確認のための、規制対応自動 LC-MS ワークフローについて説明します。

アプリケーションのメリット

• ACQUITY Premier UPLC BSM システムや ACQUITY Premier OST カラムなど、MaxPeak High Performance Surfaces（HPS）を取り入れた製品カテゴリーにより、オリゴヌクレオチド不純物分析に対して重要な利点が提供される
• 自動化された規制対応ワークフローにより、イオンペア逆相（IP-RP）LC-MS 分析法を用いる修飾オリゴヌクレオチドとその不純物のインタクト質量確認に対して、優れた質量精度（15 ppm 未満）が提供される
• さらに、この自動化された規制対応ワークフローにより、すべてのサンプル成分について、0.2% という低い存在量レベルまで純度情報が得られる

近年、低分子医薬品およびタンパク質医薬品の有力な代替品として、オリゴヌクレオチド医薬品が注目を集めています^1,2。 オリゴヌクレオチド医薬品の製造および品質管理には、非常に選択性および感度の高い LC-MS 分析法が求められます。オリゴヌクレオチド分析用に質量分析ベースの分析法として広く受け入れられているものの 1 つは、イオンペア逆相クロマトグラフィー（IP-RP）分離とそれに後続するネガティブイオンモードでの ESI-MS 検出です。この分析法を用いて、規制対応の waters_connect データ取り込みおよび解析ソフトウェアで動作する BioAccord システムを採用したオリゴヌクレオチド分析の自動ワークフローが、最近報告されました^3,4。 このアプリケーションノートでは、ACQUITY Premier UPLC BSM システム、チューナブル紫外線（TUV）検出器、ESI-Tof ACQUITY RDa 質量検出器で構成される完全に統合された LC-MS システム（図 1 に示されたシステム）を、低レベルのオリゴヌクレオチド不純物の分析に使用しました。オリゴヌクレオチドには、金属表面と強く相互作用する傾向がある負に帯電したリン酸基が多数含まれているため、その分析は困難な課題です。これらの課題に対処するため、ウォーターズは、分析が困難な分析種に対処するために特別に設計された、より不活性な表面を提供する新しいテクノロジーファミリーである MaxPeak High Performance Surfaces（HPS）を開発しました^5-10。 最近発売された ACQUITY Premier UPLC BSM システムには、分析種とすべての種類の金属表面との相互作用を大幅に低減する非常に効果的なバリアを実現するために、このテクノロジーが流路全体に導入されています。2020 年に導入された ACQUITY Premier OST カラムとともに UPLC システム全体が、最近オリゴヌクレオチドのバイオアナリシス関連 LC-MS アプリケーションについてテストされました⁹。 ここでは、オリゴヌクレオチドおよびその関連不純物のインタクト質量確認について、この UPLC システムの機能を調査しました。すべてのデータセットは、ACQUITY Premier と組み合わせた BioAccord LC-MS システムでフルスキャン MS モードで取り込み、BayesSpray 質量スペクトル電荷デコンボリューションアルゴリズムを使用して waters_connect で解析し、各化合物について正確なインタクト質量測定を行いました。

試薬およびサンプル前処理

トリエチルアミン（TEA、純度 99.5%、カタログ番号 65897-50ML）およびメタノール（LC-MS グレード、カタログ番号 34966-1L）は Honeywell（Charlotte、NC）から入手し、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール（HFIP、純度 99%、カタログ番号 105228-100G）は Sigma Aldrich（St Louis、MO）から購入しました。HPLC グレードの脱イオン水（DI）は、MilliQ システム（Millipore, Bedford, MA）を使用して精製しました。移動相は試験日に新たに調製し、使用しました。ヌクレオシドのうちの 19 種に 2'-OMe 修飾が含まれ、配列が GUA ACC AAG AGU AUU CCA UTT で元素組成が C₂₂₉H₃₀₆N₇₆O₁₄₃P₂₀ の、長さ 21-mer の高度に修飾されたオリゴヌクレオチドは、ATDBio（英国、サウサンプトン）から購入しました。ストック溶液は、濃度 1 μM（または 2.34 μg/mL）で脱イオン水中に調製してから、10 μL を注入しました。これは、21-mer のオリゴヌクレオチドのオンカラムロード 10 ピコモルに相当します。

さまざまな低レベルのオリゴヌクレオチド不純物が含まれている 21-mer オリゴヌクレオチドを、通常の 2.1 × 100 mm OST カラム（製品番号： 186003950）および最近導入された ACQUITY Premier 2.1 × 100 mm OST カラム（製品番号：186009485）の 2 種の C₁₈ カラムで分離しました。21-nt オリゴマーの場合、かなりの部分の分子（19 ヌクレオシド）に修飾核酸塩基が含まれていました（図 2 の実験のセクションに記載されている配列に示されています）。2'-OMe 修飾は、オリゴヌクレオチド配列中に青色でラベル付けされた 3 つのグアノシン（G）、および緑色でラベル付けされた 7 つのアデノシン（A）に行いました。同じ 2’-OMe 官能基がウリジンおよびシチジンに付加されることに加えて、これら 2 種のヌクレオシドの核酸塩基はさらに 5-メチル基を 1 つ付加して修飾され、2’-OMe 5-Me ウリジン 5 つ（U、紫色でラベル付け）と 2’-OMe 5-Me シチジン 4 つ（赤色でラベル付け）が生成されています。修飾されていないヌクレオシドは、21-mer の 3’ 末端にある 2 つのデオキシチミジン（TT）のみです。特別に考案された命名法を用いて、全オリゴヌクレオチド修飾の配列は、次記のように要約できます：OMEG OME5mU OMEA OMEA OME5mC OME5mC OMEA OMEA OMEG OMEA OMEG OME5mU OMEA OME5mU OME5mU OME5mC OME5mC OMEA OME5mU dT dT。ACQUITY Premier OST カラムで分析すると、図 2A に示されているように、21-nt オリゴヌクレオチドの分離により、かなり複雑な不純物プロファイルが明らかになります。14 種のオリゴヌクレオチド不純物が分離され、TUV 検出器および MS 検出器の両方で検出されました。同じサンプルを、同じ寸法で同じ固定相（C₁₈ 1.7 μm 粒子、130 Å ポア）が充塡されている従来のカラム（ステンレススチールのケーシング付き）での分析により、図 2B に示されているように同じ不純物の半分（7 種）のみが分離され、初期に溶出する不純物のかなりの部分が完全に欠落しました。最近の発表⁷によれば、未処理のカラムフリットが金属表面への分析種の吸着の主な原因です。図 2B に示されている結果は、従来のカラムのインレットおよびアウトレットのフリットでのオリゴヌクレオチドの吸着効果を考慮すれば説明がつきます。サンプルをカラムのインレットにロードすると、多量のオリゴヌクレオチド成分によってインレットフリットが不動態化され、このフリットに吸着されないオリゴヌクレオチド不純物は少量です。ただし、IP-RP 分離を行った後、オリゴヌクレオチド不純物のほとんどが主要成分の前に溶出するため、アウトレットフリットが完全に不動態化されるまで、この部分にこれらの不純物の一部が保持される可能性が非常に高くなります。図 2B に示す例では、早期に溶出する 7 種の不純物は、アウトレットフリットに吸着されたために検出されなかった可能性が非常に高いです。

ACQUITY Premier OST カラムは、MaxPeak High Performance Surfaces（HPS）テクノロジーを採用した、2 μm 以下の粒子を充塡したカラムファミリーに属します^8-10。 オリゴヌクレオチドには、UPLC システムの流路に通常存在する金属表面（ステンレススチール、チタン、Ni-Co 合金 MP35N など）と相互作用することが知られている、負に帯電したリン酸主鎖が含まれています。これらの相互作用は多くの場合、オリゴヌクレオチドの損失、クロマトグラフィーピーク形状不良、またはデータの再現性低下の原因になります。UPLC の流路および OST カラムに沿って展開された MaxPeak HPS テクノロジーにより、検出される不純物の数と % 存在量（UV ピーク面積と関連）によって実証されているように、これらの望ましくない相互作用が大幅に低減されます。従来の OST カラムでは、徹底的に不動態化を行った後でも、不純物の回収率に関してはるかに少ない結果が示されました。3 回の繰り返し注入を重ね描きした図 2C に示されているように、ACQUITY Premier カラムで行った分離には高い再現性があります。主要なオリゴヌクレオチド成分の ESI-MS スペクトルが図 3A に示されています。ESI-MS スペクトルに基づいて自信を持って同定された、存在量が最も低い不純物（UV データによると 0.18%、表 1 を参照）は、分子の 5 ’末端から 10 ヌクレオシドすべてが欠失した 11-mer オリゴヌクレオチドです。2 つの主要なチャージ状態（二価および三価荷電イオン）を示すこの不純物の ESI-MS スペクトルが、下部パネルの図 3B に示されています。UV ではこの不純物のシグナルが検出されず（図 2B を参照）、両方の実験で同じ ACQUITY Premier UPLC システムを使用しているため、予想溶出時間で取得した ESI-MS スペクトル（図 3B の上部パネル）により、この不純物が通常のカラムの内側の金属表面（非常に高い可能性としてカラムのアウトレットフリット）にトラップ（不可逆的に吸着）された可能性が高いことが、示されています。今回分析した 21-mer 中に検出されたオリゴヌクレオチド不純物の完全なリストが、その配列、元素組成、正確な平均質量、および UV ピーク面積を使用して計算したパーセント存在量とともに、表 1 に示されています。表 1 に示されているデータを用いて、waters_connect での BayesSpray 電荷デコンボリューションアルゴリズムを使用する自動解析をセットアップしました。図 4 に得られた解析結果が示されています。14 種のオリゴヌクレオチド不純物はすべて比較的広いダイナミックレンジ（約 500 倍）にわたって検出され、デコンボリューションした質量精度は 15 ppm 未満でした。

UV 検出器と MS 検出器の両方で低レベルのオリゴヌクレオチド不純物を検出できることが重要ですが、その存在量を正確に測定することは同様に重要です。言い換えれば、これらの不純物が同じダイナミックレンジ（約 500 倍）にわたって、UV で直線レスポンスを示すことが非常に重要です。UV 分析法の直線性を試験するために、21-mer のオリゴヌクレオチドを希釈し、短い ACQUITY Premier カラム（2.1 × 50 mm、製品番号：186009484）で、より高速（15 分）の LC-MS 分析を用いて分析しました。ストック溶液サンプル（1 μM）の 1:2,000 希釈に対応する最低検出濃度 0.5 nM について得られた UV クロマトグラムが、その前のブランク注入とともに図 5A に示されています。同じ溶液（0.5 nM または 1.17 ng/mL）の 4 回繰り返し注入では、ピーク面積の RSD が 15% 未満であり、図 5B に強調表示されているように、低レベルのオリゴヌクレオチドを ACQUITY Premier カラムで良い再現性で分析できることが実証されています。図 6 に、21-nt オリゴマーの広範囲の濃度（0.5 nM ～ 1000 nM の範囲の 8 濃度）に対する UV レスポンス（ピーク面積）を示すキャリブレーションプロットが示されています。総合すると、図 5A、B、および図 6 に示されているデータによって、21-mer オリゴヌクレオチドは広いダイナミックレンジ（2,000 倍）にわたって直線性のクロマトグラフィー挙動を示し、最低濃度（0.5 nM、オンカラムロード量 5 フェムトモル（または約 12 ピコグラム）に対応）でもカラム回収率が非常に優れていることが、明確に証明されています。最後に、分析した最高濃度（1 μM）のオリゴヌクレオチドの最後の繰り返し注入の直後に、溶媒 A ブランク試料（10 μL）を注入することによって、分析法のキャリーオーバーを評価しました。結果は図 5C に示されており、ACQUITY Premier UPLC システムおよびカラムの不活性が強調されています。つまり、大量の 21-mer オリゴヌクレオチド（10 ピコモル）をオンカラム注入した後、このオリゴヌクレオチドの検出可能なシグナルはありません。

結論として、ACQUITY Premier と組み合わせた BioAccord LC-MS システムにより、最低 0.2% の濃度のオリゴヌクレオチド不純物を測定して正確に検出することができ、waters_connect ソフトウェアを使用する規制対応自動ワークフローにより、インタクト質量確認機能が得られます。

• ACQUITY Premier UPLC BSM システムや ACQUITY Premier OST カラムなど、MaxPeak High Performance Surfaces（HPS）を取り入れた製品カテゴリーにより、オリゴヌクレオチド不純物分析に対して重要な利点が提供される
• 規制対応ソフトウェアで動作する ACQUITY Premier と組み合わせた BioAccord LC-MS システムを使用して、低い検出限界およびクロマトグラフィーの再現性の観点から、オリゴヌクレオチド分析の改善を実証
• このオリゴヌクレオチド不純物分析ワークフローにより、オリゴヌクレオチド不純物およびその相対存在量の質量確認機能が提供されます。この試験結果から、LC-MS プラットホームにより、修飾オリゴヌクレオチドとその不純物のインタクト質量確認で優れた質量精度（15 ppm 未満）が得られ、LC-UV 情報により、すべてのサンプル成分が相対存在量 0.2 % まで測定できることが示されています。

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