ミックスモード LC カラムと ACQUITY QDa 質量検出器を用いた有機酸の分析

標準溶液の調製

個々の OA を MilliQ 水に 1.0%（w/v）になるように溶解して、原液としました。フマル酸は、無水エタノールに 1.0%（w/v）で溶解しました。個々の OA 原液を混合して MilliQ 水で希釈し、すべての OA を含む溶液（各 600 μg/mL（有効数字 3 桁を記録））を調製しました。この OA 混合原液を水で連続希釈することにより、低濃度の溶液を調製しました。

SPE による

リンゴ、ブドウ、ザクロを含むフルーツジュースのサンプルは、地元の店舗で購入しました。このジュースを MilliQ 水に 1：10 の比率で希釈し（ジュース 1 mL に対して水 9 mL）、0.45 μm ガラスマイクロファイバーメンブレンフィルター（GMF）でろ過しました。ろ過したジュース溶液は、必要に応じて水で更に希釈しました。

クロマトグラフィーの最適化

移動相の組成

Atlantis Premier BEH C₁₈ AX カラムは、ミックスモードカラムです。固定相には C₁₈ 基が含まれているだけではなく、第三級アルキルアミン基が含まれており、約 pH 8 以下で正電荷を持ちます⁽³⁾。 移動相の組成（有機溶媒比率）が、OA の保持に重大な影響を及ぼすことが分かりました。図 2 に、様々な移動相組成でのアイソクラティック溶出における OA の保持係数（k’）を示します。50mM ギ酸アンモニウムおよび 0.9% ギ酸水溶液では、有機酸の k’ 値は 0.4～2.5 の範囲でした。有機物含有量（移動相 B、0.9% ギ酸アセトニトリル溶液）を約 50% まで増加させると、これらの酸のカラム保持が最小になり、すべての k’ 値が 0.5 未満になりました。有機物含有量を更に増加させると、OA の k’ 値は再び高くなりました。また、OA の溶出順序も、移動相の組成変更により変わりました。 

移動相のバッファー濃度

OA 分析法の最適化において、バッファー濃度はもう 1 つの主要な要素です。図 3 に示すように、これは有機酸の保持および選択性の両方に影響を与えます。ギ酸アンモニウムの濃度が 50 mM から 0 mM に減少させると、クエン酸とマロン酸の k’ は大幅に上昇しますが、他の OA の k’ の上昇は穏やかでした。クエン酸とマロン酸の k’ が大幅に上昇するのは、他の OA と比較して pK_a 値が低いことに関連しています（図 3）。OA の溶出順序も、バッファー濃度の変更に伴って変わりました。 

移動相の pH

移動相の pH も、分析法開発における重要なパラメーターです。移動相の pH は、OA の酸解離のバランスに影響を与え、これにより保持とピーク形状も影響を受けます。この試験では、良好なピーク形状を得るために pH 2.9 を使用しました。 

有機酸の分析

グラジエント溶出プログラムを開発し、OA 分析で使用しました（「実験方法」セクションを参照）。これは主にバイナリーソルベントグラジエントで、アイソクラティック溶出の追加のセグメントがあり、水にはバッファーは含まれていません（低イオン強度）。グラジエント溶出により、水にバッファーが含まれていないアイソクラティック溶出では、早期溶出する OA で良好な保持が得られ、重要なキナ酸、酒石酸、リンゴ酸については、良好な分離も得られました。

15 種の有機酸のクロマトグラムを 11 のシングルイオンレコーディング（SIR）チャンネルで収集しました（図 4）。これらの OA の分子イオン[M-H]^- の大半では、質量電荷比（m/z）が異なっていました。これらは別個の SIR チャンネルで検出され、相互干渉の可能性が排除されました。図 2 に有機酸 15 種の保持時間、定量限界（LOQ）、キャリブレーション結果を示します。溶媒溶液中の有機酸の LOQ は 0.2～6 ppm の範囲内でした（溶液中では μg/mL）。 

スパイク試験により、有機酸の定量における正確度を評価しました。リンゴ、ブドウ、ザクロジュース中の主な有機酸 4 種（キナ酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸）を 0.1 mg/mL および 4 mg/mL の 2 つのレベルでスパイクしました。AOAC ガイドラインに従って回収率⁽⁴⁾を計算し、表 3 に示します。回収率の大半が 80～120% の範囲に収まっていました。スパイク試験には外部較正を使用しました。ただし、より正確な結果が必要とされる場合には、内部標準の使用を推奨します。特に、質量分析法を用いる場合には、内部標準を使用することが、分析の正確度と精度を改善するための一般的な方法です。 

OA 分析におけるこの分析法の主なメリットを、ザクロジュースの分析で示しています。図 5 はザクロジュースの重ね描きを示しており、挿入図にクロマトグラムの重ね描きを拡大表示しています。ザクロジュースに含まれる 0.007 mg/mL という低濃度の酒石酸の濃度が測定できました（表 3 参照）。図 5 では、酒石酸の SIR クロマトグラムにおける平坦なベースラインと、酒石酸のピーク付近（RT 1.5 分）に見られるピークの数が注目に値します。このような低レベルでの酒石酸の定量では、多くのピークが近接して溶出し、非選択的検出器では定量が非常に難しくなります。酒石酸は偽装ザクロジュース用のマーカーとして使用されました。偽装ザクロジュースの酒石酸のレベルは 0.07 mg/mL 以上であることが分かりました⁽⁵⁾。 フルーツジュースの真正性試験において、この例のザクロジュースの酒石酸などの OA の高感度検出が必要となります。

OA 分析は、サンプルに存在する可能性のある多数の天然に存在する OA の分離が難しいことから、困難な作業になる場合があります。Waters UPLC/QDa システムと Atlantis Premier BEH C₁₈ AX カラムにより、OA 分析のための優れたアプローチを実現できます。この OA 分析アプローチの主なメリット：

• 優れた保持と分離能の改善
• 特定のアプリケーションにメリットをもたらす高感度検出
• サンプルマトリックス中の共溶出化合物の干渉を受けにくい高選択性検出
• 実行時間 8 分未満の高速分析

1. Monica Gonzalez and Venerando Gonzalez.Organic Acids in Food Analysis by HPLC; 3^rd ed.Leo M.L. Nollet, Fidel Toldra., Eds; CRC Press Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, 2013, pp 443.
2. Hyoung S. Lee, HPLC Method for Separation and Determination of Non-Volatile Organic Acids in Orange Juice, J. Agric.Food Chem.1993, 41, 1991–1993.
3. Thomas H. Walter, Bonnie A. Alden, Cheryl Boissel, Jessica Field, Nicole Lawrence, Donna Osterman, and Amit Patel, A New Mixed-Mode Reversed-Phase/Anion-Exchange Stationary Phase Based on Hybrid Particles, Waters Application Note, Waters Corporation, 720006742en, 2020.
4. AOAC Guidelines for Single-Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals (2012) Official Methods of Analysis, 19^th Ed., Appendix K, AOAC INTERNATIONAL, Rockville, MD, USA.http://www.eoma.aoac.org/app_k.pdf.
5. Stefan Ehling and Shannon Cole, Analysis of Organic Acids in Fruit Juices by LC-MS: An Enhanced Tool for Authenticity Testing, J. Agric.Food Chem.2011, 59, 2229–2234.