Approcci Pratici all'Isolamento dei Peptidi

Mentre l'isolamento tradizionale dei peptidi viene generalmente eseguito utilizzando la rivelazione UV, l'isolamento guidato dalla massa semplifica il processo di purificazione con una discriminazione meno ambigua tra il peptide target e i contaminanti formatisi durante la sintesi e il clivaggio. La rivelazione di massa può essere utilizzata per valutare l'identità e l'omogeneità dei picchi in cromatogrammi complessi e per incrementare la produttività dei campioni. Lo sviluppo di una separazione che includa sia la rivelazione di massa che quella UV garantisce un profilo cromatografico più completo del campione. I composti che non ionizzano, o che ionizzano in modo insufficiente, vengono spesso rivelati con lunghezze d'onda UV basse. Al contrario, i peptidi con estinzione UV molto bassa vengono in genere rivelati facilmente con MS.

Solventi

I solventi comunemente utilizzati nell'isolamento dei peptidi, tra cui acetonitrile, metanolo, etanolo e isopropanolo, sono tutti compatibili con l'elettronebulizzazione (ESI) e altre tecniche di ionizzazione atmosferica. Tuttavia, l'acetonitrile fornisce in genere la migliore risoluzione, selettività, simmetria dei picchi ed efficienza. La minore viscosità dell'acetonitrile riduce anche la contro-pressione del sistema LC quando viene utilizzato per gli isolamenti cromatografici. La volatilità, così come la capacità del solvente di cedere protoni, sono entrambe importanti per l'ESI. I solventi organici volatili riducono la tensione superficiale delle goccioline formate nella sorgente MS, il che favorisce una migliore ionizzazione e una sensibilità incrementata. Molti peptidi vengono analizzati e isolati utilizzando modificatori acidi, come l'acido formico o l'acido trifluoroacetico, sebbene il TFA sopprima in una certa misura la ionizzazione. Se è necessaria la commutazione positivo-negativo per lo sviluppo del metodo, le fasi mobili di acetato di ammonio o formiato di ammonio sono scelte accettabili e compatibili con MS. Per una migliore separazione dei peptidi a pH elevato sono adatte fasi mobili realizzate con bicarbonato di ammonio. Per ridurre la possibilità di precipitazione nel rivelatore di massa, utilizzare tamponi volatili a concentrazioni pari o inferiori a 20 mM.

Gestione della Rivelazione

Considerazioni speciali devono essere rivolte alla rivelazione in cromatografia preparativa. I picchi ad alta concentrazione eccedono l'intervallo lineare della maggior parte dei rivelatori e le velocità di flusso elevate non sono compatibili con l'hardware dei rivelatori. Alcuni rivelatori, come MS ed ELSD, sono distruttivi. È pertanto necessario ridurre efficacemente il flusso e la concentrazione che raggiungono i rivelatori e al contempo ridurre al minimo la perdita di campione. Uno splitter di flusso passivo viene comunemente utilizzato per dividere e diluire il campione prima che questo raggiunga i rivelatori (Figure 47 e 48). Un solvente di reintegro diluisce il campionamento del flusso di preparazione e lo trasferisce ai rivelatori.

Gli splitter passivi sono fabbricati per essere utilizzati con un intervallo di velocità di flusso cromatografico e un rapporto di split specifici. Il sistema idraulico dello splitter deve corrispondere alla velocità di flusso adeguata alla colonna selezionata. Nei casi in cui i picchi eluiscono a concentrazioni più elevate, vengono utilizzati rapporti di split più alti. Nella Tabella 6 sono mostrati gli splitter di flusso comunemente utilizzati e i relativi rapporti di split.

Tabella 6. Splitter passivi disponibili da Waters.

In alternativa alla divisione passiva del flusso, uno splitter attivo campiona meccanicamente il flusso di preparazione a una velocità commisurata al rapporto di split programmato. Il flusso campionato viene quindi diluito e trasportato ai rivelatori dal solvente di reintegro. Tuttavia, gli splitter attivi disturbano spesso la linea di base e, inoltre, l'usura meccanica compromette di frequente le prestazioni. Gli splitter di flusso passivi e attivi sono ugualmente efficaci nel campionamento del flusso di preparazione, quindi il tipo di splitter utilizzato dipende dalle preferenze dell'utilizzatore.

Modificatori

Fasi mobili e modificatori specifici sono scelti in base all'uso previsto del peptide da isolare. Come discusso in precedenza, il modificatore della fase mobile è un additivo che controlla il carattere ionico del peptide aumentando o abbassando il pH. Esso può anche aumentare l'idrofobicità del campione formando coppie ioniche con le catene laterali e i terminali del peptide che presentano una carica. Per questo scopo viene comunemente usato acido trifluoroacetico.

L'accoppiamento ionico incrementa l'interazione del peptide con la fase stazionaria idrofobica della colonna e, di conseguenza, la qualità della separazione generalmente migliora. Sfortunatamente, le coppie ioniche forti formate con TFA non possono essere spezzate facilmente con le condizioni utilizzate nella ionizzazione per elettronebulizzazione. Di conseguenza, vengono ionizzate meno molecole di peptidi e l'intensità del segnale è ridotta. Teoricamente, il modificatore più adatto sarebbe quello in grado di formare coppie ioniche per migliorare la separazione cromatografica, senza tuttavia ostacolare la ionizzazione per elettronebulizzazione.

Apffel, et al. hanno proposto l'aggiunta post-colonna di un acido debole che sarebbe in concorrenza con il TFA per accoppiarsi con l'analita. Con un acido debole a una concentrazione abbastanza alta da spingere la concorrenza in modo da favorire la protonazione del TFA, il TFA protonato può essere evaporato e l'analita può ionizzare in modo più efficiente. La sensibilità e l'intensità del segnale MS vengono incrementate. Anche se a questo scopo possono essere utilizzati molti acidi diversi a concentrazioni differenti, è stato utilizzato con successo acido propionico allo 0,1% in un rapporto 1:1 acqua/organico come solvente di reintegro nella purificazione guidata dalla massa.

Massa Monoisotopica rispetto a Massa Media

Mentre la purificazione guidata dalla massa riduce l'ambiguità nell'isolamento dei target peptidici, è importante considerare quali masse dovrebbero essere utilizzate per l'attivazione delle frazioni. Per la maggior parte degli isolamenti di piccole molecole, la massa monoisotopica è la massa principale utilizzata per l'identificazione, mentre gli altri addotti ionici correlati sono definiti e monitorati in base a questo valore. Per molecole più grandi come i peptidi, a volte viene utilizzata la massa media come identificatore primario.

La massa monoisotopica viene calcolata utilizzando la massa degli isotopi più abbondanti di ciascun elemento nella molecola, mentre la massa media viene calcolata utilizzando la media ponderata di tutti gli isotopi di ciascun elemento presenti naturalmente nella molecola. Di conseguenza, per i peptidi, la massa media può essere notevolmente superiore alla massa monoisotopica. All'aumentare del numero di atomi di carbonio nella molecola aumenta la probabilità che sia presente più 13_C, il che a sua volta incrementa il peso molecolare.

Inoltre, la massa monoisotopica potrebbe non essere il picco più abbondante nello spettro di massa. Anche se non esiste una regola per definire quando utilizzare la massa monoisotopica o la massa media, l'intervallo di peso molecolare 1500–1700 rappresenta generalmente il punto di passaggio all'utilizzo della massa media per l'attivazione dei peptidi. Nella pratica, molti programmi software disponibili calcolano sia il valore medio che il valore m/z monoisotopico per gli stati della carica dei peptidi. È più prudente includere entrambe le alternative come attivatori. Le scelte migliori per l'attivazione saranno evidenti durante l'analisi di screening prima dell'isolamento.

Stati della Carica

L'elettronebulizzazione, una tecnica che ionizza i campioni in condizioni miti e genera molecole con cariche multiple, è spesso utilizzata nella purificazione guidata dalla massa. Anche se alcuni peptidi possono avere pesi molecolari superiori al limite di massa superiore dell'analizzatore, gli ioni a carica multipla con valori m/z inferiori in genere rientrano nell'intervallo di massa dello spettrometro. Diversi fattori influenzano gli stati di carica dei peptidi, tra cui il pH della soluzione, il numero di gruppi funzionali acidi e basici e le proprietà fisiche del solvente utilizzato nell'analisi.

Come discusso in precedenza, il processo di isolamento dei peptidi inizia in genere con l'analisi. Vengono calcolati il peso molecolare e gli eventuali stati di carica per facilitare l'identificazione del prodotto peptidico. Mentre il profilo del campione grezzo rivela l'entità dello sviluppo del metodo necessario per migliorare la risoluzione che porterà all'isolamento del prodotto puro, l'analisi fornisce anche informazioni sugli stati della carica. Considerare lo spettro di massa derivato dal cromatogramma di corrente ionica totale analitico mostrato in Figura 49. La massa peptidica calcolata era 1772.9 ed è presente lo ione a carica positiva (1773.9), sebbene in quantità molto ridotta. Lo ione a carica doppia a 887.8 è di gran lunga lo ione presente in maggiore abbondanza. Una piccola quantità di ione a carica tripla (592.3) e un'impurezza (781.2) sono presenti in quantità minori. Nonostante la presenza di ioni a carica multipla nello spettro di massa, il peptide viene rivelato come picco singolo nel cromatogramma. In modo prevedibile, i picchi a carica doppia e tripla eluiscono contemporaneamente nei cromatogrammi di carica ionica estratti (Figura 50).

Attivatori della Raccolta di Frazioni

La carica multipla di peptidi spesso rende difficile prevedere le specie più abbondanti in un dato esperimento MS. Pertanto, gli attivatori di frazione per l'isolamento peptidico che utilizza la purificazione guidata dalla massa devono includere tutti gli ioni a carica multipla previsti.

Raccolta dei Dati: Continui vs. Centroidi

A causa della complessità dei campioni peptidici, della probabilità di molteplici stati della carica e delle alternative di utilizzo della massa monoisotopica o media all'aumentare della lunghezza del peptide, i dati MS devono essere raccolti in modalità continua. I dati continui mostrano l'intensità osservata di tutti i punti risolti sull'asse della massa. Essi includono l'imprecisione statistica nella misurazione di m/z di una particolare intensità. Questo segnale grezzo può quindi essere processato per produrre l'intensità di ciascuno dei possibili segnali di massa sovrapposti. Ciò consente la discriminazione di m/z molto simili. I dati centroidi sono dati continui processati in modo da visualizzare un singolo punto di dati centrato per ogni distribuzione di ioni in uno spettro di massa e sono visualizzati come barre nello spettro di massa (Figura 51).

Esempi di Isolamento Peptidico Guidato dalla Massa

I due peptidi seguenti, forniti dalla Dott.ssa Kelly Wasmund di Research Genetics, Inc. (Huntsville, AL, Stati Uniti), sono stati isolati mediante purificazione guidata dalla massa utilizzando i principi discussi:

• NH2-ISQAVHAAHAEINEAGR-COOH (abbreviato come ISQA)
• NH2-SIINFEKL-COOH (abbreviato come SIIN)

Ciascun peptide è stato bagnato singolarmente in 0,5 mL di dimetilformammide (DMF) e quindi diluito con acqua a 5,0 mL. Si è stimato che la concentrazione di ISQA fosse 5–10 mg/mL e la concentrazione di SIIN fosse 10 mg/mL. Le condizioni per le separazioni su piccola scala di ciascuno dei peptidi sono riportate nella Tabella 7; i risultati cromatografici e spettrali sono presentati rispettivamente nelle Figure 52 e 53. Gli ioni target calcolati per i vari stati della carica di ISQA e SIIN sono mostrati nella Tabella 8.

Piccola Scala
Solvente A: 0,1% TFA in acqua
Solvente B: 0,1% TFA in acetonitrile
Vol. iniezione: 40 µL
Colonna: 4,6 × 50 mm Symmetry 300, C_18, 5 µm

Larga Scala
Solvente A: 0,1% TFA in acqua Solvente B: 0,1% TFA in acetonitrile
Vol. iniezione: 5 mL
Colonna: 30 × 150 mm Symmetry 300, C_18, 7 µm
Masse target: (ISQA) [M+H]+ = 1773.9, [M+2H]2+ = 887.5, [M+3H]3+ = 592.2, [M+4H]4+ = 447.2
Masse target: (SIIN) [M+H]+ = 963.5, [M+2H]2+ = 482.3, [M+3H]3+ = 321.9

Tabella 7. Condizioni del gradiente utilizzate nelle separazioni su piccola scala di ISQA e SIIN.

Tabella 8. Ioni target calcolati per i vari stati della carica di ISQA e SIIN.

Comprensione delle curve di van Deemter

I gradienti focalizzati per ciascuno dei peptidi sono stati progettati per migliorare la risoluzione tra il peptide target e i suoi contaminanti a eluizione ravvicinata. Il gradiente preparativo focalizzato per ISQA è stato avviato al 12%B e ha raggiunto il 20%B, con l'eluizione del peptide vicino al 17%B (Tabella 9 e Figura 54). Analogamente, il gradiente preparativo focalizzato per SIIN è variato nell'intervallo 23%–31%B, con l'eluizione del prodotto vicino al 28%B (Tabella 10 e Figura 55). Gli attivatori di massa per la raccolta delle frazioni includevano gli ioni a carica multipla previsti (Tabella 8).

Comprensione delle curve di van Deemter

Tabella 9. Gradiente di preparazione focalizzato utilizzato per la purificazione di ISQA.

Tabella 10. Gradiente di preparazione focalizzato utilizzato per la purificazione di SIIN.

Le frazioni risultanti dalle analisi preparative sono state analizzate per valutarne la purezza. Sono stati utilizzati più canali di rivelazione per monitorare l'analisi al fine di fornire una caratterizzazione completa delle frazioni. L'analisi delle frazioni di entrambi i peptidi ISQA e SIIN è stata eseguita con lo stesso metodo del gradiente utilizzato per l'analisi dei peptidi grezzi. I risultati per ISQA e SIIN sono mostrati rispettivamente nelle Figure 56 e 57.

Conclusione

I peptidi continuano a costituire un'importante nicchia nel campo delle terapie con tecnologie nuove e migliorate per la sintesi, la progettazione di farmaci, la scoperta, lo sviluppo e la produzione. Nonostante i cambiamenti nella tecnologia, i fondamenti dell'isolamento peptidico rimangono invariati con molte procedure operative basate sull'HPLC in fase inversa accoppiata a UV e rivelazione della massa. L'analisi del peptide grezzo utilizzando un gradiente rapido, la focalizzazione del gradiente e il ridimensionamento geometrico su una colonna più grande con la diluizione in colonna e il controllo della temperatura sono mezzi efficaci per isolare rapidamente i peptidi target. Anche se la rivelazione UV è ampiamente utilizzata nell'isolamento dei peptidi, la purificazione guidata dalla massa riduce il numero di frazioni raccolte e il tempo necessario per la successiva analisi delle frazioni. La gestione del segnale del rivelatore tramite la tecnologia di split e diluizione, l'utilizzo di fasi mobili cromatografiche, modificatori e solventi di reintegro appropriati e la selezione di stati della carica ragionevoli per l'attivazione delle frazioni semplificano il protocollo di purificazione dei peptidi.