Guida all’UPLC per Principianti

Se si pensa alla risoluzione cromatografica nel senso più elementare del termine, si tratta semplicemente dell’ampiezza [w] di due picchi rispetto alla distanza [t_R,2–t_R,1] tra tali picchi. Se siamo in grado di avvicinare o allontanare tra loro tali picchi, possiamo migliorare la risoluzione.

La risoluzione può essere espressa matematicamente in termini più pertinenti tramite l’equazione fondamentale di risoluzione. L’equazione di risoluzione è costituita da parametri fisici e chimici che influenzano la risoluzione cromatografica; l’efficienza [N], la selettività [α] e la ritenzione [k]. La selettività e la ritenzione sono i fattori chimici storicamente più facili da manipolare per migliorare la risoluzione. Questi parametri possono essere influenzati da variazioni relative a temperatura, solvente di eluizione, composizione della fase mobile e chimica della colonna. L’efficienza è un parametro fisico [meccanico] più difficile da manipolare, a causa della sua influenza della radice quadrata sulla risoluzione. Tuttavia, l’efficienza può avere un impatto significativo sulla risoluzione se la dimensione delle particelle è molto piccola. La tecnologia UPLC punta a migliorare la risoluzione utilizzando particelle di dimensioni inferiori a 2 µm per migliorare l’efficienza del sistema.

È più facile comprendere l’effetto di questi parametri sulla risoluzione se si pensa a come questi tre termini sono rappresentati cromatograficamente [Figura 15]. La ritenzione [k] e la selettività [α] sono fattori chimici che spostano i picchi l’uno rispetto all’altro e misurano l’interazione degli analiti con la fase stazionaria e la fase mobile. È possibile migliorare la risoluzione aumentando k. Tuttavia, ciò provoca tempi di ritenzione più lunghi, minore sensibilità e maggiori ampiezze dei picchi. Un aumento di α può comportare una maggiore risoluzione, lo stesso ordine di eluizione dei picchi in un periodo di tempo simile e/o una modifica dell’ordine di eluizione. L’efficienza [N] è una misura fisica dell’allargamento di banda in una separazione. Supponendo che N venga migliorato riducendo la dimensione delle particelle del materiale di impaccamento, la distanza tra i centri dei picchi non cambia. Inoltre, una riduzione delle dimensioni delle particelle si traduce in picchi cromatografici più stretti ed efficienti, migliorando così la risoluzione e la sensibilità.

La Relazione tra Risoluzione, Efficienza e Dimensione delle Particelle

La tecnologia UPLC massimizza il contributo fisico [meccanico] alla risoluzione riducendo al minimo l’allargamento di banda dello strumento e consentendo l’utilizzo di colonne con particelle più piccole [1,7 µm–1,8 µm] e a maggiore efficienza. Con semplici esempi cromatografici e operazioni aritmetiche elementari è possibile comprendere meglio i principi cromatografici alla base della tecnologia UPLC.

Come indicato nell’equazione fondamentale di risoluzione, la risoluzione è direttamente proporzionale alla radice quadrata dell’efficienza.

Inoltre, l’efficienza è inversamente proporzionale alla dimensione delle particelle. Ciò significa che se la dimensione delle particelle del materiale di impaccamento diminuisce, l’efficienza di separazione aumenta. Per esempio, se la dimensione delle particelle del materiale di impaccamento viene ridotta da 5 µm a 1,7 µm [3´], la teoria prevede che l’efficienza dovrebbe incrementare di 3´, con conseguente aumento della risoluzione di 1,7´ [radice quadrata di 3].

Per ottenere i guadagni in termini di efficienza e risoluzione previsti dalla teoria, la velocità di flusso ottimale deve essere applicata in base alle dimensioni delle particelle. La velocità di flusso ottimale [F_opt] è inversamente proporzionale alla dimensione delle particelle. Ciò significa che se la dimensione delle particelle viene ridotta da 5 µm a 1,7 µm [3’], la velocità di flusso ottimale per l’analisi di tale particella incrementa di 3’, con conseguente riduzione del tempo di analisi dello stesso grado [3´] e conseguente aumento della produttività dei campioni.

Una delle prime cose che osserviamo in qualità di cromatografi è ciò che accade quando viene modificata la velocità di flusso cromatografica. Se si aumenta la velocità di flusso, il tempo di analisi si riduce. Inoltre, diminuisce anche l’ampiezza del picco. Man mano che l’ampiezza del picco si restringe, l’altezza di tale picco aumenta in proporzione. Picchi più stretti ma più alti sono più facili da rivelare e da differenziare dal rumore di fondo [S/N più elevato], con conseguente maggiore sensibilità.

Questi principi teorici sono stati applicati cromatograficamente. Come osservato nella Figura 20, quando l’allargamento di banda extra-colonna è ridotto al minimo, come nel caso dello strumento ACQUITY UPLC, è possibile ottenere il rendimento teorico di una colonna.

La discussione precedente dimostra l’importanza dell’allargamento di banda intra-colonna. Se si riesce a comprendere ulteriormente quali processi influenzano l’allargamento di banda e come ridurlo, è possibile ottenere miglioramenti nell’efficienza e, di conseguenza, nella risoluzione.

Comprensione delle Curve di van Deemter

Come descritto in precedenza, l’ampiezza di un picco può essere considerata come una distribuzione statistica delle molecole dell’analita [varianza, σ²]. L’ampiezza del picco aumenta in modo lineare in proporzione alla distanza percorsa dal picco. La relazione tra l’ampiezza del picco e la distanza percorsa dal picco è un concetto chiamato altezza equivalente a una piastra teorica [HETP o H]. Originaria della teoria della distillazione, H è una misura delle prestazioni della colonna che tiene conto di diversi processi correlati all’allargamento di banda. In altre parole, più piccolo è il valore HETP, più piastre [N] sono presenti in una colonna [Figura 21].

Se si pensa a cosa avviene a livello molecolare all’interno di una colonna [come le molecole dell’analita interagiscono con la fase mobile e la fase stazionaria], si possono comprendere ulteriormente i diversi processi correlati alla diffusione che contribuiscono al rendimento cromatografico [Figura 22].

Esistono diversi processi correlati alla diffusione che si verificano simultaneamente:

1. Le molecole dell’analita vengono trasportate sulla superficie della particella e intorno a tale particella [diffusione vorticosa].
2. Le molecole degli analiti vengono diffuse avanti e indietro nella fase mobile dell’eluato [diffusione longitudinale].
3. Le molecole degli analiti si diffondono all’interno e all’esterno dei pori cromatografici [trasferimento di massa].

Questi processi correlati alla diffusione possono essere espressi matematicamente sotto forma dell’equazione di van Deemter.

L’equazione di van Deemter è costituita da tre termini:

• Il termine A [diffusione vorticosa] è correlato principalmente alla dimensione delle particelle del materiale di impaccamento. Il suo valore è anche determinato dalla qualità dell’impaccamento del letto cromatografico. Esso è anche correlato all’uniformità o alla non uniformità del flusso verso e intorno a una particella.
• Il termine B [diffusione longitudinale] è correlato alla diffusione dell’analita nella fase mobile dell’eluato e nella fase stazionaria e diminuisce all’aumentare della velocità della fase mobile [velocità lineare].
• Il termine C [trasferimento di massa] è correlato sia alla velocità lineare [la velocità della fase mobile] sia al quadrato delle dimensioni delle particelle. Per trasferimento di massa si intende l’interazione delle molecole dell’analita con la superficie interna della fase stazionaria e la loro distanza di diffusione all’interno e all’esterno dei pori del materiale di impaccamento.

È possibile osservare singolarmente questi termini tracciandoli su una scala dell’HETP in funzione della velocità lineare [u] della fase mobile [Figura 24].

Il termine A viene tracciato come una linea orizzontale. Esso è correlato alle dimensioni delle particelle e alla qualità dell’impaccamento della colonna ed è indipendente dalla velocità lineare [velocità della fase mobile]. Man mano che la dimensione delle particelle del materiale di impaccamento si riduce, diminuisce anche il valore di H [maggiore efficienza].

Il termine B viene tracciato come curva inclinata verso il basso con velocità lineare crescente. Questo termine è indipendente dalle dimensioni delle particelle e indica che se la fase mobile si muove a una velocità lineare più lenta, le molecole dell’analita restano nella colonna per un tempo più lungo e, pertanto, esiste una maggiore possibilità di allargamento [diffusione] di banda all’interno della colonna. Al contrario, se la fase mobile si muove a una velocità lineare più elevata, il tempo di diffusione è minore e, di conseguenza, vi è meno tempo perché si verifichi un allargamento di banda.

Il termine C viene tracciato come una relazione lineare crescente tra H e u. All’interno di una distribuzione di molecole, alcune di esse entrano in un poro della fase stazionaria mentre altre rimangono nella fase mobile in movimento fino a raggiungere un’altra particella. Segue il processo inverso, in cui le molecole immobilizzate si staccano e si spostano più in basso nel letto cromatografico. L’ingresso e l’uscita dai pori da parte di una molecola richiedono tempo e, di conseguenza, quando le molecole si trasferiscono da una particella all’altra, la banda dell’analita che contiene tali molecole si allarga spostandosi lungo la colonna. Più piccole sono le particelle della fase stazionaria, più rapido è il processo che impedisce l’allargamento di banda dell’analita. Se la fase mobile si sposta velocemente, si sviluppa una distanza maggiore tra le molecole immobilizzate e quelle che si spostano in avanti. Ciò indica che, affinché la popolazione di molecole di analita resti insieme, la fase mobile dovrebbe spostarsi a una velocità lineare più bassa. All’aumentare della velocità della fase mobile, la popolazione di molecole di analita diventa più dispersa, con conseguente incremento dell’allargamento di banda.

Sommando i termini A, B e C si ottiene una curva di van Deemter [Figura 25]. Se si esegue una separazione alla velocità lineare alla quale si trova il punto più basso della curva, si otterrà la massima efficienza e, di conseguenza, la massima risoluzione cromatografica.

Correlando questo risultato all’equazione di van Deemter mostrata in Figura 23, se la dimensione delle particelle viene ridotta della metà, H diminuisce di un fattore 2. Pertanto, è possibile ridurre l’allargamento di banda all’interno di una colonna utilizzando particelle più piccole.

Per esempio, la Figura 26 illustra un grafico di van Deemter di una particella da 10 µm e una particella da 5 µm. Come osservato nel grafico, una particella di grandi dimensioni da 10 µm ha un intervallo operativo ottimale molto ristretto rispetto alla velocità lineare per ottenere il valore di H più basso [18 µm a 0,7 mm/s]. Se la velocità della fase mobile è troppo bassa o troppo elevata, si osserva un incremento di H [perdita di efficienza], con conseguente riduzione della risoluzione e della sensibilità cromatografica. Tuttavia, la particella da 5 µm presenta un valore di H molto più basso, [10 µm a 0,95 mm/s; maggiore efficienza] a una velocità della fase mobile più elevata, nonché a un intervallo di velocità lineare più ampio in cui è possibile ottenere tale valore H. Ciò significa che è possibile ottenere un’efficienza più elevata e, di conseguenza, una risoluzione maggiore rispetto a una colonna impaccata con particelle più grandi, da 10 µm.

Per comprendere meglio questo effetto, è possibile studiare ulteriormente l’influenza della dimensione delle particelle sui singoli termini dell’equazione di van Deemter.

La dimensione delle particelle ha un impatto significativo sulla banda dell’analita in quanto correlata al termine A [diffusione vorticosa]. Il percorso seguito dalle molecole dell’analita per trasferirsi dalla fase mobile dell’eluato alla superficie della particella e intorno a tale particella richiede meno tempo se la dimensione delle particelle diminuisce. Le particelle più grandi fanno sì che le molecole dell’analita percorrano percorsi più lunghi e indiretti. Le differenze tra questi percorsi comportano tempi di migrazione diversi per le molecole dell’analita all’interno di una popolazione, con conseguente banda dell’analita e picco risultante più larghi. Man mano che la dimensione delle particelle di impaccamento diminuisce, i percorsi delle molecole dell’analita diventano più simili in termini di lunghezza. Ciò provoca bande di analita più strette che si traducono in picchi più stretti, maggiore efficienza e maggiore sensibilità [Figura 27].

La diffusione longitudinale, il termine B, non è direttamente influenzata dalla dimensione delle particelle. Tuttavia, man mano che le dimensioni delle particelle diminuiscono, gli altri parametri dell’equazione di van Deemter, ovvero i termini A e C, diventano più piccoli. Di conseguenza, la velocità lineare ottimale [velocità della fase mobile] aumenta, con conseguente riduzione delle opportunità di allargamento della banda. Una velocità lineare più bassa consente alla banda di molecole dell’analita di interagire con il materiale di impaccamento per un periodo di tempo più lungo. Ciò significa che c’è più tempo per la diffusione assiale [longitudinalmente] nella fase mobile, con conseguenti bande dell’analita più larghe e diffuse. A una velocità lineare più elevata, la popolazione di molecole di analita viene trascinata attraverso la colonna in un periodo di tempo più breve, il che consente alla banda dell’analita di rimanere più concentrata, il che si traduce in picchi più stretti a maggiore efficienza a causa del minor tempo a disposizione per la diffusione longitudinale [Figura 28].

Il termine C [trasferimento di massa] è influenzato sia dalla velocità lineare sia dalle dimensioni delle particelle. Le popolazioni di molecole dell’analita vengono trasportate dalla fase mobile alla superficie delle particelle. Le molecole dell’analita attraversano quindi la fase mobile nei pori fino allo strato superficiale legato (per esempio C₁₈, C₈, ecc.), interagiscono con la fase legata vengono quindi trascinate nuovamente fuori dal poro nella fase mobile dell’eluato. Tuttavia, le molecole dell’analita all’interno della popolazione entrano ed escono dal poro in misura diversa. Ciò significa che quando le molecole ritornano alla fase mobile dell’eluato, la lunghezza del cammino percorso da ciascuna molecola dell’analita è diversa, con conseguente allargamento [ampiamento] della banda dell’analita [Figura 29]. L’entità dell’allargamento di banda dipende dalla velocità della fase mobile [Figura 30].

Ad una velocità lineare elevata, il tempo intercorso tra l’interazione delle molecole con la superficie delle particelle e il trasferimento attraverso la fase mobile è maggiore. Più elevata è la velocità della fase mobile, più rapidamente le molecole dell’analita si muovono attraverso la colonna, producendo una banda di analita più larga e meno concentrata. Ciò si traduce in un picco cromatografico più ampio e in una minore sensibilità.

A una velocità lineare bassa, la durata dei passaggi tra le interazioni con la superficie è minore. Ciò si traduce in una banda di analita più concentrata e di conseguenza in picchi cromatografici più stretti ed efficienti.

Il trasferimento di massa migliora notevolmente quando la dimensione delle particelle diminuisce a causa della sua relazione con il quadrato delle dimensioni delle particelle [d_p²]. Nel caso di particelle più piccole, una molecola di analita impiega meno tempo per entrare nei pori, interagire con la superficie cromatografica ed essere riportata nella fase mobile. Pertanto, le molecole degli analiti separate su colonne di particelle più piccole si diffondono molto più rapidamente, producendo una banda cromatografica più nitida, più stretta e più efficiente [Figura 31].

La riduzione delle dimensioni delle particelle migliora pertanto il trasferimento di massa, diminuendo così efficacemente la pendenza del termine C, che ci porta all’attuale tecnologia UPLC. Come si può osservare nel grafico di van Deemter in Figura 32, le particelle da 1,7 µm forniscono valori di HETP di 2-3´ inferiori rispetto alle particelle da 3,5 µm. Inoltre, questi valori più bassi di H si ottengono a una velocità lineare più elevata e su un intervallo più ampio di velocità. Ciò significa che il trasferimento di massa è notevolmente migliorato con le particelle più piccole, consentendo una migliore efficienza e risoluzione. Ciò significa anche che è possibile utilizzare un intervallo maggiore di velocità lineari per ottenere prestazioni migliorate. Le separazioni possono essere eseguite a velocità lineari più elevate, migliorando così la velocità di analisi senza compromettere la risoluzione.

L’Impatto dell’Allargamento di Banda [Strumentale] Extra-colonna sui Grafici di van Deemter

Poiché la tecnologia UPLC ha guadagnato slancio e popolarità nei laboratori cromatografici, i grafici di van Deemter sono diventati un metodo popolare per misurare l’aumento delle prestazioni di particelle di dimensioni inferiori a 2 µm rispetto alle dimensioni delle particelle esistenti per HPLC. Può essere possibile trarre conclusioni errate se queste misurazioni comparative non vengono eseguite su una strumentazione che riduce al minimo il contributo dell’allargamento di banda extra-colonna.

Per dimostrare l’importanza dell’allargamento di banda extra-colonna sulla misurazione delle prestazioni, sono stati generati grafici di van Deemter su uno strumento per HPLC convenzionale [allargamento di banda = 7,2 µL], confrontando particelle da 1,7 µm con particelle da 2,5 µm [Figura 33]. Il substrato delle particelle e la chimica della fase legata delle due colonne erano identici. A prima vista, dai grafici di van Deemter si potrebbe dedurre che non vi sono differenze apprezzabili nel rendimento di queste due colonne. Come può essere?

In questo caso, l’allargamento di banda dello strumento per HPLC provoca una misurazione di rendimento simile della colonna UPLC con particelle da 1,7 µm rispetto alla colonna HPLC con particelle da 2,5 µm. Le inferiori larghezze dei picchi prodotte dalle colonne UPLC con particelle da 1,7 µm sono influenzate maggiormente dall’allargamento di banda extra-colonna rispetto alle colonne impaccate con particelle più grandi [per esempio 2,5 µm], producendo quindi questo risultato fuorviante.

Lo stesso esperimento è stato quindi condotto su uno strumento ACQUITY UPLC [allargamento di banda = 2,8 µL]. Lo strumento ACQUITY UPLC presenta un volume di sistema inferiore di circa l’84% e un allargamento di banda inferiore del 60% rispetto allo strumento per HPLC.

Come illustrato nella Figura 34, si osserva una notevole differenza nelle prestazioni di queste due colonne quando si utilizza lo strumento ACQUITY UPLC. Oltre alle differenze osservate nell’HETP, la velocità lineare ottimale aumenta da 3,0 mm/s [particelle da 2,5 µm] a 10,0 mm/s [particelle da 1,7 µm], a dimostrazione dei guadagni in termini di rendimento derivanti da una minore HETP [efficienza più elevata] e da una velocità lineare più bassa [e quindi maggiore produttività] associata alla tecnologia UPLC.

Mantenimento dell’Integrità della Separazione senza Compromessi

Ora che è stata stabilita una conoscenza di base delle funzioni di allargamento di banda extra-colonna e intra-colonna, possiamo correlare la misura di tali termini [HETP rispetto a velocità lineare] in un modo più pratico: piatti teorici rispetto a velocità di flusso.

Come discusso in precedenza, la velocità lineare è la velocità della fase mobile mentre attraversa la colonna. Si tratta di un termine utilizzato per normalizzare la velocità di flusso della fase mobile indipendentemente dal diametro interno della colonna, in modo da misurare e confrontare il rendimento di colonne di dimensioni diverse. La velocità lineare ottimale è direttamente correlata alla velocità di flusso ottimale [Figura 35]. Per ottenere il rendimento ottimale, le colonne HPLC convenzionali possono essere utilizzate solo in un intervallo ristretto di velocità di flusso. Operando al di fuori di questo intervallo è possibile che si verifichi una riduzione del rendimento.

Un approccio comune per ridurre il tempo di analisi [migliorare la produttività] nell’HPLC convenzionale è quello di aumentare semplicemente la velocità di flusso. Con particelle più grandi, l’incremento della velocità di flusso si traduce spesso in una perdita sostanziale di efficienza, e quindi di risoluzione, poiché si opera al di sopra della velocità lineare ottimale per la particella HPLC [cromatografia compressa]. Si tratta di un compromesso significativo tra il rendimento cromatografico e la velocità di analisi associata all’HPLC [Figura 36].

La tecnologia UPLC non è soggetta a questi compromessi. Il tempo di analisi può essere ridotto senza compromettere il rendimento. Quando la dimensione delle particelle viene ridotta da 3,5 µm a 1,7 µm, si osserva un aumento significativo dell’efficienza [Figura 37]. Ciò è dovuto alle bande cromatografiche strette prodotte dalle colonne UPLC con particelle da 1,7 µm a causa del trascurabile allargamento di banda intra-colonna. Inoltre, questa maggiore efficienza si verifica a una velocità di flusso più elevata [Figura 37]. Ciò significa che, a parità di lunghezza della colonna, è possibile ottenere un notevole aumento dell’efficienza e, di conseguenza, della risoluzione in un tempo di analisi più breve.

Comprensione del Potere di Risoluzione della Colonna [L/dp]

Quando si esegue una separazione cromatografica, l’obiettivo principale è quello di scindere (risolvere) i componenti in modo da poterne misurare alcuni o tutti. Il potere di risoluzione massimo di una colonna può essere stimato dividendo la lunghezza della colonna [L] per la dimensione delle particelle [d_p]. Il rapporto L/d_p è particolarmente utile quando si cerca di determinare la dimensione delle particelle del materiale di impaccamento e la lunghezza della colonna necessarie per una determinata applicazione [Figura 38].

Questo rapporto può essere utilizzato anche come strumento per trasferire i metodi da una dimensione delle particelle a un’altra. Una colonna con un rapporto L/d_p di 30 000 [separazione moderatamente impegnativa] è una scelta molto comune. Come si può vedere nella Figura 39, una tipica colonna HPLC che produce una potenza di risoluzione di 30 000 è lunga 150 mm ed è impaccata con particelle da 5 µm. Poiché la dimensione delle particelle diminuisce, è possibile ottenere la stessa potenza di risoluzione in una colonna più breve [il che significa tempi di analisi più rapidi, ovvero una colonna lunga 50 mm impaccata con particelle da 1,7 µm raggiunge un rapporto L/d_p di 30 000]. Oltre alla riduzione della lunghezza della colonna, la velocità di flusso ottimale aumenta al diminuire delle dimensioni delle particelle, il che contribuisce ulteriormente a ridurre il tempo di analisi.

Ciò è dimostrato più chiaramente dall’analisi cromatografica [Figura 40]. Una colonna UPLC lunga 50 mm impaccata con particelle da 1,7 µm produce la stessa potenza di risoluzione di una colonna HPLC lunga 150 mm impaccata con particelle da 5 µm. Mantenendo costante il rapporto L/d_p, il tempo di analisi si riduce di 10’ mentre si mantiene la risoluzione. Le velocità di flusso sono state regolate in proporzione inversa a ciascuna dimensione delle particelle. I volumi di iniezione sono stati ridimensionati in proporzione al volume della colonna in modo da iniettare lo stesso carico di massa sulla colonna.

Comprendere il ruolo del rapporto lunghezza colonna-dimensione delle particelle [L/d_p] è fondamentale per la comprensione della tecnologia UPLC. La tecnologia UPLC si basa sull’impaccamento efficiente di piccole particelle resistenti alla pressione in colonne corte [ad alta produttività] o lunghe [ad alta risoluzione]. Queste colonne UPLC sono utilizzate in uno strumento per LC progettato in modo da funzionare alla velocità lineare ottimale [e alla pressione risultante] per queste particelle con minimo allargamento di banda.

Misurazione delle Prestazioni di Separazione in Gradiente [Peak Capacity]

In condizioni isocratiche, i piatti teorici [N] costituiscono una misura dei contributi cumulativi di allargamento di banda dello strumento e della colonna. A causa dell’allargamento di banda correlato alla diffusione, l’ampiezza di una banda dell’analita aumenta quanto più a lungo la banda dell’analita viene trattenuta sulla fase stazionaria.

In un’analisi a gradiente, la forza di eluizione della fase mobile cambia nel corso dell’analisi. Ciò fa sì che le bande di analiti trattenuti in modo più forte si muovano più rapidamente attraverso la colonna [modificando così il tempo di ritenzione], mantenendo le bande più concentrate [strette]. Nella cromatografia in fase inversa, la forza crescente di eluizione della fase mobile controlla l’ampiezza delle bande prodotte, con conseguenti ampiezze dei picchi simili mentre le bande attraversano il rivelatore. Poiché l’ampiezza del picco e il tempo di ritenzione vengono modificati dall’intensità variabile della fase mobile, i piatti teorici [a causa della loro relazione con l’ampiezza del picco] non è una misura valida per le separazioni in gradiente.

La potenza di risoluzione [separazione] di un gradiente può essere calcolata in base alla sua peak capacity [P_c]. Pertanto, la peak capacity è semplicemente il numero teorico di picchi che possono essere separati in un determinato tempo del gradiente. La peak capacity è inversamente proporzionale all’ampiezza del picco. Pertanto, affinché P_c aumenti, l’ampiezza del picco deve diminuire.

La peak capacity può essere notevolmente incrementata utilizzando la tecnologia UPLC. ’elevata potenza di risoluzione della tecnologia UPLC consente di generare più informazioni per unità di tempo sfruttando la potenza delle particelle inferiori a 2 µm su strumentazione a dispersione eccezionalmente bassa [allargamento di banda di 2,8 µL]. In questo modo è possibile raccogliere più informazioni da un determinato campione. Per esempio, un digerito triptico di fosforilasi b produce ~70 picchi identificati utilizzando una colonna HPLC impaccata con particelle da 5 µm [Figura 43A]. Con la tecnologia UPLC, il numero di picchi identificabili aumenta da 70 a 168, migliorando così l’affidabilità nell’identificazione delle proteine [Figura 43B].