Guía para principiantes sobre cromatografía de exclusión por tamaño

Para asignarle un peso molecular a cada segmento de tiempo de retención que corresponda al polímero eluido, es necesario calibrar el sistema, o más específicamente, el conjunto de columnas. Hay varias formas de hacer esto, pero la más fácil es utilizar una calibración relativa basada en un conjunto de patrones de polímeros bien caracterizados con una distribución de peso molecular lo más estrecha posible. Lo ideal sería utilizar un conjunto de patrones monodispersos, es decir, un solo peso molecular, con una relación promedio en peso y número (dispersión) que sea igual a uno, (Mw/Mn = 1).

Lo más cerca que podemos estar a lograrlo es utilizando patrones de polímeros polimerizados específicamente para este fin, como los patrones estrechos de poliestireno polimerizado aniónicamente. Los patrones cubren un intervalo de peso molecular muy amplio, desde monómeros hasta pesos moleculares >10 000 000, con una dispersión <1,10. Para que un patrón de calibración se considere realmente estrecho y aceptable para su uso en la calibración por GPC, la dispersión debe ser <1,10. También hay maneras de realizar una calibración con patrones amplios y se puede utilizar el procedimiento de calibración universal de Benoit (con o sin un viscosímetro en línea). Se analizará cada uno de ellos con cierto detalle:

Calibración relativa con patrón estrecho

A la técnica de calibración convencional con patrón estrecho se la denomina calibración relativa porque los promedios de los pesos moleculares obtenidos son relativos a la solución de calibración. Por ejemplo, si se analiza polietileno como muestra y se calibra el conjunto de columnas con patrones estrechos de poliestireno, los pesos moleculares obtenidos después de la integración se basarían en el poliestireno y serían incorrectos para el polietileno. Sin embargo, esto está bien para las personas que simplemente comparan los pesos moleculares obtenidos para un valor desconocido con un conjunto de valores "aceptables". No importa si estos valores de peso molecular son realmente "absolutos" para el polímero de interés, siempre y cuando los valores obtenidos estén en el intervalo aceptable.

Hay algunos otros patrones estrechos disponibles para la GPC orgánica, como los poli(metilmetacrilatos), poliisoprenos, polibutadienos y poli(tetrahidrofuranos), pero ciertamente el poliestireno es el principal patrón estrecho que se utiliza para el análisis por GPC orgánica. En el caso de la GPC acuosa, los poli(óxidos de etileno) son los más utilizados, junto con los polietilenglicoles para el bajo peso molecular, y los pululanos, que son polisacáridos basados en estructuras de triosa. Después de analizar la serie de patrones estrechos, se realiza un ajuste polinómico (normalmente de tercer o quinto orden) y se representa gráficamente la curva de calibración logM resultante frente al tiempo de retención (o volumen).

Calibración con patrones estrechos

También se puede calibrar el conjunto de columnas de GPC utilizando un patrón amplio que sea el mismo polímero que se está analizando como valor desconocido. El patrón amplio se puede adquirir de diferentes proveedores, debe estar bien caracterizado con los siguientes datos: número, peso, valor Z y con los pesos moleculares promedio de la viscosidad determinados mediante métodos alternativos (osmometría de membrana, dispersión de la luz, ultracentrifugación, por ejemplo). Una alternativa sería utilizar una "muestra" real de material (que esté presente en una cantidad significativa), en la que los promedios de peso molecular se hayan determinado mediante estas otras técnicas. La ventaja de esto es que se puede utilizar un polímero con la misma estructura que las muestras desconocidas que se analizan día tras día.

Los promedios de peso molecular conocidos se introducen en el software y el patrón amplio se somete a cromatografía de la manera habitual, en las mismas condiciones en las que serán sometidas a cromatografìa las muestras desconocidas. El software realiza una rutina de búsqueda Simplex, y ajusta la forma del patrón amplio sometido a cromatografía a los promedios de peso molecular dados. La curva de calibración resultante constará de los puntos de datos de cada promedio. Si solo se proporciona un número y un peso promedio, la curva de calibración resultante constará de estos dos puntos más el peso molecular máximo, o una curva de calibración de tres puntos. Este patrón amplio se basa en el trabajo realizado por Hamielec en 1969. Se recomienda utilizar dos patrones amplios de diferentes pesos moleculares para aumentar el intervalo de pesos moleculares de la curva de calibración. Incluso utilizando dos patrones amplios con dos promedios de peso molecular conocidos, solo se obtiene una curva de calibración de seis puntos (utilizando los valores de peso molecular de los picos a partir del resultado de la rutina de búsqueda). Sin embargo, para el laboratorio de control de calidad que analiza el mismo polímero todos los días, en el mismo intervalo de pesos moleculares que los patrones amplios, esta calibración funciona muy bien y proporciona pesos moleculares absolutos.

Hay algunos otros patrones estrechos disponibles para la GPC orgánica, como los poli(metilmetacrilatos), poliisoprenos, polibutadienos y poli(tetrahidrofuranos), pero ciertamente el poliestireno es el principal patrón estrecho que se utiliza para el análisis por GPC orgánica. En el caso de la GPC acuosa, los poli(óxidos de etileno) son los más utilizados, junto con los polietilenglicoles para el bajo peso molecular, y los pululanos, que son polisacáridos basados en estructuras de triosa. Después de analizar la serie de patrones estrechos, se realiza un ajuste polinómico (normalmente de tercer o quinto orden) y se representa gráficamente la curva de calibración logM resultante frente al tiempo de retención (o volumen).

Calibración universal

El concepto de calibración universal fue introducido por Benoit, et. al. en 1967. En lugar de representar gráficamente el logaritmo del peso molecular de una serie de patrones estrechos frente a la retención, se representa gráficamente el logaritmo del producto de la viscosidad intrínseca [η] y el peso molecular M frente a la retención. El producto [η] M está relacionado con el volumen hidrodinámico. Benoit descubrió que graficar una serie de valores de volumen hidrodinámico para una variedad de patrones estrechos producía una curva de calibración única. En otras palabras, todos los puntos se ajustan a la misma curva. Una vez que se ha establecido esta calibración "universal", se puede analizar cualquier polímero de tipo bobina aleatoria en el eluyente adecuado y determinar el peso molecular en función de la curva universal. Benoit utilizó un viscosímetro capilar de vidrio para medir las viscosidades de los patrones estrechos y las muestras. Después de establecer la curva universal, también se puede representar gráficamente el logaritmo de la viscosidad intrínseca frente al logaritmo del peso molecular para los patrones estrechos. Esta representación gráfica se denomina gráfico de la ley de viscosidad o gráfico de Mark-Houwink. La pendiente de este gráfico es alfa (a veces llamada α) y la intersección se denomina log K. La ecuación resultante, conocida como ecuación de Mark-Houwink, es la siguiente:

El manual de polímeros contiene muchos valores de K y alfa para diversas combinaciones de polímeros/eluyentes. Estas constantes empíricas se pueden introducir en muchos de los paquetes de software de GPC comerciales disponibles en la actualidad a fin de obtener pesos moleculares "absolutos" o exactos para varios polímeros. Es necesario asegurarse de que los valores del manual sean exactos para el polímero que se va a analizar, de lo contrario se producirán errores. 

En la actualidad, se puede utilizar un detector de viscosímetro en línea, junto con el detector del índice de refracción diferencial (dRI), para obtener directamente el peso molecular de cada corte. El dRI es el detector de concentración (C) y el detector de viscosímetro proporciona el producto de la viscosidad intrínseca por la concentración ([η] C). Dividir la señal del viscosímetro por la señal dRI nos da la viscosidad intrínseca [n i] de cada corte a través del pico del polímero. Ahora conocemos tanto la viscosidad intrínseca como, por supuesto, el tiempo de retención (o volumen) de cada corte, por lo que podemos volver a la curva de calibración universal y obtener el peso molecular de cada corte, Mi. Este concepto de calibración universal tiene una amplia aplicabilidad, especialmente para los polímeros de tipo bobina aleatoria, que son la mayoría de los polímeros que se analizan en la actualidad. Otras conformaciones de polímeros, como varillas, esferas o formas globulares (como las proteínas) pueden no comportarse según los conceptos universales. Para que funcione la calibración universal, no debe haber interacción del polímero y el eluyente o material de relleno de la columna.  

Otra ventaja de utilizar la calibración universal y la detección de viscosímetro/dRI en línea es la capacidad de determinar qué tan ramificado está un polímero con relación a un patrón de polímero lineal conocido. Esta técnica es bastante sensible a la ramificación de cadena larga (a diferencia de la ramificación de cadena corta) y es importante ya que ayuda a predecir cómo se procesará un polímero determinado, o cuáles serán las propiedades físicas finales en comparación con la contraparte lineal. 

Como ejemplo, se puede analizar un polímero amplio de polietileno lineal (como “NBS 1475” o cualquier otro polietileno lineal conocido) determinando los valores de Mark-Houwink resultantes a partir del experimento. El gráfico de Mark-Houwink resultante (o gráfico de la ley de viscosidad) será lineal, con una pendiente constante (alfa será constante en toda la distribución del peso molecular). Los valores de K y alfa se pueden introducir en el software y se pueden analizar los polietilenos desconocidos posteriores comparando el gráfico de la ley de viscosidad con el gráfico del polietileno lineal conocido.

Si el producto desconocido presenta ramificaciones de cadena larga, la relación viscosidad/peso molecular no es lineal; es decir, la viscosidad no aumentará linealmente con el peso molecular. Cuanto mayor sea esta desviación respecto de la linealidad, mayor será el nivel de ramificación de la cadena larga. Se puede obtener un valor de alfa exacto para un polímero ramificado solo a pesos moleculares bajos, donde no haya ramificaciones de cadena larga y la pendiente sea constante. Una vez que el polímero alcanza un peso molecular en el que haya ramificaciones de cadena larga, el valor de alfa cambia continuamente (puede incluso llegar a cero) y deja de tener sentido. La relación simple del gráfico de la ley de viscosidad del polímero ramificado frente al polímero lineal nos da el índice de ramificación, (g'), donde: g' = [η ]br/[η]lin. Para determinar la frecuencia de ramificación, qué tipo de ramificación está presente, etc. se pueden realizar más cálculos. Es obvio que agregar un detector de viscosímetro en línea con un detector del índice de refracción puede proporcionar mucha más información sobre el polímero, específicamente:

• Pesos moleculares "absolutos" o exactos para los polímeros mediante calibración universal.
• Cálculo de la viscosidad intrínseca del polímero
• Determinación de la ramificación

Realizar un análisis por GPC

El criterio más importante al prepararse para realizar un análisis por GPC es encontrar un eluyente adecuado para disolver el polímero. Esto suena bastante trivial, pero hay que recordar que la GPC es una técnica de separación basada en el tamaño del polímero en solución. Las cadenas de polímero se abrirán a una cierta conformación relajada en solución, y el eluyente elegido determinará cuál será el tamaño. Muchos polímeros son solubles a temperatura ambiente en varios eluyentes, pero en algunos casos (especialmente para los polímeros altamente cristalinos) se requiere una temperatura alta para la disolución. Otro aspecto importante para la preparación de muestras para GPC es la concentración elegida. Si la carga de masa de la muestra en el conjunto de columnas es demasiado alta, puede haber efectos de concentración o viscosidad que darán lugar a volúmenes de elución incorrectos. Otra consideración es si se debe filtrar o no la solución del polímero. Se analizarán algunas de estas consideraciones para la preparación de muestras.

Tener en cuenta que en muchos casos en los que se muestra el nitrato de sodio, muchos analistas han utilizado acetato, sulfato, cloruro de sodio, etc. Se recomienda el nitrato de sodio ya que ha demostrado reducir al mínimo las interferencias iónicas de manera muy consistente para los compuestos neutros y aniónicos. El motivo para recomendar estos eluyentes es la carga aniónica total del material de relleno. El empaquetado de gel a base de metacrilato para la GPC acuosa tiene una carga aniónica global que puede causar exclusión de iones para las muestras aniónicas y adsorción de iones para las muestras catiónicas si se analiza solo en agua. 

Siempre se debe filtrar el eluyente al vacío antes de utilizarlo en el sistema cromatográfico. Con los eluyentes orgánicos se suele utilizar un filtro de fluorocarbono. El tamaño de poro del filtro de membrana es generalmente de 0,45 µm (micras). Para la GPC acuosa (filtración de agua), se utiliza un filtro de membrana de tipo acetato. Cuando se prepara un análisis de dispersión de la luz, es recomendable filtrar el eluyente a través de un filtro de 0,20 µm. Algunos eluyentes orgánicos, como el DMF, son muy viscosos y no humedecen del todo bien la superficie del filtro de fluorocarbono. Se recomienda humedecer la superficie del filtro inicialmente con metanol y después iniciar rápidamente la filtración con DMF. A continuación, se descartaría este pequeño volumen de mezcla de metanol/DMF y, luego, se iniciaría la filtración con DMF antes de que el filtro se seque.

Concentración

Una vez que se ha elegido el eluyente adecuado para el análisis, el siguiente paso es preparar el patrón estrecho y las soluciones de muestra. Es necesario tener cuidado de utilizar suficiente concentración para poder obtener una relación señal-ruido aceptable, pero sin riesgo de sobrecargar la columna y provocar efectos de concentración. La siguiente tabla es una "regla empírica" general que se utilizará como guía para determinar la concentración que se debe preparar. Estas concentraciones están en porcentaje, donde 1.0 mg/mL es 0.10 %. No se realiza ninguna corrección para la temperatura, por lo que se asume que todo se prepara a temperatura ambiente. Recordar que en caso de estar realizando un análisis de viscosimetría o de dispersión de la luz, es necesario determinar la masa exacta inyectada. Esto requerirá correcciones de densidad si el análisis se realiza a temperatura elevada. Las concentraciones mostradas se deben utilizar asumiendo un volumen de inyección máximo de 100 µL por columna. 

Preparar las muestras

Una vez que se han disuelto con éxito los patrones y las muestras en el eluyente elegido, y se han instalado las columnas de GPC, se puede comenzar a realizar las inyecciones. La siguiente elección es si filtrar o no la solución de muestra. En casi todos los casos, se debe filtrar la solución de muestra antes de la inyección.  

Por lo general, como en el caso de la filtración con eluyente comentada anteriormente, se elegiría un filtro de membrana de fluorocarbono de 0.45 µm. En algunos casos, cuando hay partículas muy finas (como carbón negro, dióxido de titanio, sílice u otras rellenos), se puede utilizar un filtro de 0,20 μm.  

Obviamente, cuando empezamos a utilizar tamaños de filtro muy finos, el cizallamiento del polímero se puede convertir en un problema. Filtrar un polímero de alto peso molecular a través de un filtro de 0.20 µm causaría sin duda alguna degradación por cizallamiento. Es posible que haya que optar por no filtrar la muestra en absoluto y esperar que no haya un aumento de presión debido a la obstrucción del filtro en línea del sistema o la frita de la columna.  

Ahora es posible comenzar a realizar las inyecciones de patrones y muestras. Como se mencionó anteriormente, se inyectará un máximo de 100 μL por columna, a las concentraciones que se muestran en la tabla. El tiempo de análisis será de aproximadamente 15 minutos por columna a un flujo de 1,0 mL/min, por lo que el tiempo de análisis para un conjunto de tres columnas sería ~45 min.  

Una vez que se ha analizado la secuencia de las muestras, es momento de que el sistema de tratamiento de datos procese los resultados según el método de integración designado y proporcione un informe completo. Esto se puede hacer automáticamente en el modo "Run and Report" (analizar e informar) en el software Empower, o se puede elegir ir a cada archivo de datos originales e integrar manualmente cada muestra.