Guía de iniciación a la cromatografía líquida

En la figura H, tres compuestos de colorante están representados por tres picos separados en el tiempo en el cromatograma. Cada uno eluye en una ubicación específica, medida por el tiempo transcurrido entre el momento de la inyección [tiempo cero] y el momento en que el pico máximo eluye. Al comparar el tiempo de retención [t_R] de cada pico con el de los patrones de referencia inyectados en el mismo sistema cromatográfico [misma fase móvil y estacionaria], un cromatografista puede identificar cada compuesto.

En el cromatograma que se muestra en la figura I-1, el cromatografista sabía que, en estas condiciones del sistema LC, el analito, la acrilamida, se separaría y eluiría de la columna a los 2,85 minutos [tiempo de retención]. Siempre que se inyectaba una nueva muestra que contenía acrilamida en el sistema LC en las mismas condiciones, aparecía un pico a los 2,85 minutos [consultar la muestra B en la figura I-2].

[Para comprender mejor por qué algunos compuestos se mueven más lentamente [se retienen mejor] que otros, revisar los Modos de separación por HPLC].

Una vez establecida la identidad, el siguiente dato importante es la cantidad de cada compuesto presente en la muestra. El cromatograma y los datos relacionados del detector nos ayudan a calcular la concentración de cada compuesto. Básicamente, el detector responde a la concentración de la banda de compuestos a medida que atraviesa la celda de flujo. Cuanto más concentrado esté, más fuerte será la señal; esto se considera una mayor altura del pico por encima de la línea base.

En la Figura I-2, los cromatogramas de las muestras A y B, en la misma escala de tiempo, se apilan uno encima del otro. Se inyectó el mismo volumen de muestra en ambos análisis. Ambos cromatogramas muestran un pico a un tiempo de retención [t_R] de 2,85 minutos, lo que indica que cada muestra contiene acrilamida. Sin embargo, la muestra A muestra un pico mucho mayor para la acrilamida. El área debajo de un pico [recuento del área del pico] es una medida de la concentración del compuesto que representa. Este valor de área es integrado y calculado automáticamente por la estación de datos del ordenador. En este ejemplo, el pico de acrilamida en la muestra A tiene un área 10 veces mayor que el de la muestra B. Utilizando patrones de referencia, se puede determinar que la muestra A contiene 10 picogramos de acrilamida, que es diez veces la cantidad de la muestra B [1 picogramo]. Obsérvese que hay otro pico [no identificado] que eluye a los 1,8 minutos en ambas muestras. Debido a que los recuentos de áreas para este pico en ambas muestras son aproximadamente iguales, este compuesto desconocido puede tener la misma concentración en ambas muestras.

Funcionamiento isocrático y en gradiente del sistema de cromatografía líquida (LC)

En la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se utilizan dos modos de elución básicos. El primero se llama elución isocrática. En este modo, la fase móvil (ya sea un eluyente puro o una mezcla de eluyentes) permanece igual a lo largo de todo el análisis. En la figura J-1 se describe un sistema típico.

El segundo tipo se denomina elución en gradiente, en el que, como su nombre indica, la composición de la fase móvil cambia durante la separación. Este modo resulta útil para muestras que contienen compuestos con un amplio intervalo de polaridades cromatográficas [consultar la sección sobre los modos de separación por HPLC]. A medida que avanza la separación, se incrementa la fuerza de elución de la fase móvil para eluir los componentes de la muestra retenidos con más fuerza.

En el caso más simple, que se muestra en la figura J-2, hay dos botellas de eluyentes y dos bombas. El controlador de gradiente controla la velocidad de cada bomba para que distribuya una mayor o menor cantidad de cada eluyente durante el transcurso de la separación. Los dos flujos se combinan en un mezclador para crear la composición real de la fase móvil que se distribuirá hasta la columna. Al principio, la fase móvil contiene una mayor proporción del eluyente más débil [Eluyente A]. Con el tiempo, la proporción del eluyente más fuerte [Eluyente B] se incrementa según el gradiente predeterminado. Obsérvese que en la figura J-2, el mezclador está situado después de las bombas; por lo tanto, el gradiente se crea a alta presión. Otros sistemas HPLC están diseñados para mezclar varios flujos de eluyentes en condiciones de baja presión, después de una sola bomba. Una válvula generadora de gradientes selecciona entre las cuatro botellas de eluyente y va cambiando la fuerza de la fase móvil a medida que transcurre el tiempo [consultar la figura J-3].

Escala de HPLC [analítica, preparativa y de proceso]

Se ha analizado cómo la HPLC proporciona datos analíticos que se pueden utilizar tanto para identificar como para cuantificar los compuestos presentes en una muestra. Sin embargo, también se puede utilizar la HPLC para purificar y recoger las cantidades deseadas de cada compuesto, utilizando un colector de fracciones situado después de la celda de flujo del detector. Este proceso se denomina cromatografía preparativa [consultar la figura K].

En la cromatografía preparativa, el científico puede recoger los analitos individuales a medida que se eluyen de la columna [p. ej., en este ejemplo: amarillo, después rojo y después azul].

El colector de fracciones recoge selectivamente el eluato que ahora contiene un analito purificado durante un periodo de tiempo especificado. Los recipientes se mueven de forma que cada uno recoja un solo pico de analito.

Un científico determina los objetivos de nivel y la cantidad de pureza. Junto con el conocimiento de la complejidad de la muestra y la naturaleza y concentración de los analitos deseados en relación con los componentes de la matriz, estos objetivos, a su vez, determinan la cantidad de muestra que se debe procesar y la capacidad requerida del sistema HPLC. En general, a medida que aumenta el tamaño de la muestra, el tamaño de la columna de HPLC será mayor y la bomba necesitará una mayor capacidad de caudal volumétrico. Determinar la capacidad de un sistema HPLC se denomina seleccionar la escala de HPLC. La tabla A enumera varias escalas de HPLC y sus objetivos cromatográficos.

La capacidad de maximizar la selectividad con una combinación específica de fases estacionarias y móviles de HPLC, logrando la mayor separación posible entre dos componentes de interés de la muestra, es fundamental para determinar los requisitos para ampliar una separación [consultar el análisis sobre los modos de separación por HPLC]. La capacidad se convierte entonces en una cuestión de escalar el volumen de la columna [V_c] a la cantidad de muestra que se va a inyectar y elegir un tamaño de partícula adecuado [determina la presión y la eficacia; consultar el debate sobre el poder de separación]. El volumen de la columna, que es una función de la longitud del lecho [L] y del diámetro interno [i.d.], determina la cantidad de material de relleno [partículas] que puede contener (consultar la figura L).

En general, las columnas de HPLC varían de 20 mm a 500 mm de longitud [L] y de 1 mm a 100 mm de diámetro interno [i.d.]. A medida que aumenta la escala de la cromatografía, también aumentan las dimensiones de la columna, especialmente el área de la sección transversal. Para optimizar el rendimiento, los caudales de la fase móvil deben aumentar en proporción al área de la sección transversal. Si se desea un tamaño de partícula más pequeño para obtener una mayor potencia de separación, las bombas deben diseñarse para soportar caudales de volumen de fase móvil más altos a contrapresión alta. La tabla B presenta algunas pautas sencillas para seleccionar el diámetro interno de la columna y el intervalo de tamaño de partícula recomendado para cada escala de cromatografía.

Por ejemplo, una aplicación a escala semipreparativa [X roja] utilizaría una columna con un diámetro interno de 10 a 40 mm que contenga partículas de 5 a 15 micras. A continuación, se podría calcular la longitud de la columna en función de la cantidad de compuesto purificado que se necesita procesar durante cada análisis y de la potencia de separación necesaria.