Guía de iniciación a la cromatografía de convergencia

Dada la amplia gama de selectividades de la cromatografía de convergencia que se ha descrito anteriormente, esta técnica es apta para una gran variedad aplicaciones (tabla 5).

Independientemente del área de mercado o de la naturaleza exacta de los analitos evaluados, la CC es idónea para superar dificultades analíticas por tres motivos principales:

• Simplifica el flujo de trabajo.
• Separa compuestos con similitud estructural.
• Es un modo ortogonal de separación de la LC de fase reversa.

A continuación, explicamos los beneficios clave de CC con algunas de sus aplicaciones.

Uno de los descubrimientos más útiles realizados durante la evolución de la SFC a la CC es cómo el CO₂ comprimido se mezcla con una amplia gama de eluyentes orgánicos para realizar análisis cromatográficos de una manera que antes no era posible. En esta sección explicaremos cómo la CC puede simplificar notablemente el flujo de trabajo en un laboratorio analítico.

La simplificación del flujo de trabajo, desde la recogida inicial de muestras hasta el análisis final, es lo que representa el mayor impacto comercial para los laboratorios analíticos. La CC tiene la capacidad de simplificar notablemente el flujo de trabajo en muchas de sus aplicaciones, lo que se traduce en un ahorro de tiempo y costes, un menor potencial de error y un aumento de la productividad. Algunos ejemplos de estas simplificaciones son:

• La combinación de varias técnicas (LC y GC).
• La combinación de varios métodos (LC de fase normal y LC de fase reversa).
• La reducción del tiempo de preparación de muestras.

Combinación de varias técnicas: análisis de lípidos

El análisis de los lípidos es importante por diversas razones. En la industria farmacéutica, se estudian los perfiles de los lípidos para determinar el impacto de la eficacia del fármaco en los sujetos, tanto los de control como los que reciben la dosis.

En investigación clínica, los niveles de lípidos se estudian como biomarcadores en diferentes enfermedades, así como para determinar la eficacia del tratamiento. En aplicaciones alimentarias, se perfilan determinadas clases de lípidos (los triglicéridos, por ejemplo) con fines nutricionales o para determinar la autenticidad del producto. En los materiales químicos, se analizan los ácidos grasos y los triglicéridos en los productos derivados del petróleo, como el biodiésel. Dependiendo del resultado deseado, el análisis de lípidos requiere diferentes técnicas. Para los ácidos grasos libres, se suele recurrir a la GC y requiere derivatizar el ácido graso libre al éster metílico de ácido graso (FAME) para mejorar la forma de pico y los límites de detección, especialmente para las cadenas de carbono más largas. La derivatización puede llevar varias horas y el análisis mediante GC resultante puede tardar hasta treinta minutos. Los lípidos más polares, como los fosfolípidos y los esfingolípidos, suelen requerir de HILIC o LC de fase normal para separar las diferentes clases de lípidos (según la naturaleza del grupo de cabeza polar). A continuación, se utiliza LC de fase reversa para detectar más lípidos hidrofóbicos dentro de una clase, en función de la longitud de la cadena de carbono y/o de la cantidad de dobles enlaces. Como se puede observar, un perfil lipídico completo requiere múltiples técnicas. Este no es el caso de la CC, que separa todas las clases de lípidos en una sola inyección. La figura 40 muestra el perfil de lípidos completo de un extracto de corazón de ratón, obtenido con el sistema ACQUITY UPC². En este ejemplo, una columna BEH y un gradiente genérico separan las diferentes clases de lípidos, lo que da como resultado una separación similar a la obtenida mediante LC de fase normal o HILIC.

Respecto a los lípidos neutros (es decir, el triacilclicerol (TG), el diacilglicerol (DG), los ésteres de colesterol (CE) y los ácidos grasos libres), solo con modificar las condiciones de la columna y del gradiente se retienen y separan los diferentes lípidos de cada clase, en función de la longitud de las cadenas de ácidos grasos y de la cantidad de dobles enlaces (figura 41).

La CC no solo es más rápida que la GC (hasta 10 veces) para esta aplicación, sino que no se requiere derivatización, lo que simplifica notablemente el flujo de trabajo general del análisis de lípidos. Al no tener que derivatizar, se ahorra tiempo y se minimizan posibles errores al añadir estos pasos adicionales al flujo de trabajo. Sin CC, este tipo de creación de perfiles y análisis específicos puede requerir hasta tres técnicas diferentes, lo que da lugar a una menor velocidad de análisis de muestras, un mayor uso de eluyentes, tiempos de análisis más largos y un aumento del coste general del análisis.

Combinación de varios métodos de LC: vitaminas liposolubles

El análisis de vitaminas liposolubles es importante para la industria farmacéutica, la investigación y el diagnóstico clínicos, y las industrias de alimentos y combustibles. El análisis de las vitaminas y carotenoides liposolubles se realiza habitualmente mediante LC de fase reversa o normal (tabla 6). Dada la dificultad para separar estos compuestos en una sola inyección, se analizan individualmente utilizando diferentes columnas y fases móviles, con análisis que duran entre 10 y 30 minutos. Con la CC esto es diferente, ya que analiza todas las vitaminas y compuestos relacionados en menos de 10 minutos (figura 42). A diferencia de los métodos de análisis tradicionales enumerados en la tabla 6, el eficiente método de la CC solo requiere usar una columna, una condición de fase móvil y un detector. Con la CC, los eluyentes se inyectan directamente, a menudo utilizando los mismos eluyentes utilizados para extraer o disolver estos compuestos (ejemplos: isooctano y hexano), y no es necesario cambiar el eluyente, lo que normalmente sí se requiere en análisis de fase reversa.

Reducción del tiempo de preparación de las muestras

Además de separar los analitos más rápidamente gracias a la posibilidad de combinar varias técnicas y métodos, la CC suele ser capaz de reducir el tiempo de preparación de las muestras. La compatibilidad de la CC con los eluyentes orgánicos ofrece los siguientes beneficios:

• La eliminación de los pasos de hidrólisis y/o derivatización.
• La eliminación de la evaporación y la reconstitución para cambiar el eluyente.
• La reducción del número de pasos de manipulación, lo que reduce los errores experimentales y mejora la calidad de los datos.

Consideremos, por ejemplo, los múltiples pasos de preparación de muestras y análisis que se necesitan para las vitaminas liposolubles en los alimentos. En la figura 43 se muestra un flujo de trabajo de muestra habitual para el análisis de las vitaminas A, D y E en los alimentos. Nótese que las vitaminas A y E requieren un procedimiento de preparación de muestras diferente al de la vitamina D. Además, se requieren tres análisis separados mediante HPLC (tanto de fase normal como de fase reversa) para cada vitamina. La preparación de las muestras para el análisis de vitamina D es particularmente compleja y puede conllevar muchos pasos, incluso una etapa de HPLC semipreparativa en algunos casos.

El procedimiento de preparación de muestras para analizar las mismas vitaminas mediante CC es mucho más sencillo (figura 44), debido a la compatibilidad de la técnica con los eluyentes orgánicos apolares utilizados al principio del proceso de extracción. En el ejemplo, al inyectar la muestra directamente de la extracción con hexano, se puede cuantificar la vitamina E. Después, se concentra para analizar las vitaminas A y D3, lo que hace que los análisis sean 20 veces más rápidos que con los métodos tradicionales de análisis. Además, CC requiere solo tres pasos de preparación de muestras, un método y un solo instrumento, mientras que el flujo de trabajo tradicional que se muestra en la Figura 43 requiere 12 pasos de preparación de muestras y tres métodos en dos instrumentos diferentes. La tabla 7 resume las ventajas de la CC en las aplicaciones analizadas y resalta otras en las que los científicos analíticos se beneficiarían de una simplificación similar.

Separación rápida de compuestos estructuralmente similares

Los isómeros y los análogos estructurales son a veces difíciles de separar por su similitud estructural, especialmente en el caso de los isómeros ópticos. Analizamos ahora el uso de la CC para los siguientes compuestos estructuralmente similares:

• Separaciones quirales (enantiómeros y diastereómeros).
• Isómeros posicionales (que difieren en la ubicación de los grupos funcionales).
• Análogos estructurales.
  • Biomarcadores (conjugados o no conjugados).
  • Fármacos (metabolitos, impurezas, productos de degradación).

Los diferentes enantiómeros de un compuesto suelen tener diferentes perfiles de potencia y toxicidad y, por lo tanto, deben controlarse a lo largo de las fases de investigación, desarrollo y producción. Las separaciones quirales se realizan predominantemente mediante LC de fase normal, utilizando fases estacionarias basadas en celulosa o amilosa. No es fácil realizar separaciones por gradiente mediante LC de fase normal. Requieren diferentes análisis isocráticos en diferentes columnas, con diferentes combinaciones de fases móviles y, muchas veces, con eluyentes altamente tóxicos. El proceso de desarrollo del método puede llevar bastante tiempo. Gracias a la capacidad de la CC de analizar gradientes y cubrir un amplio espacio de selectividad con eluyentes no tóxicos, los científicos analíticos pueden desarrollar separaciones quirales en un solo día.

Los químicos de purificación han visto la utilidad de la SFC para este tipo de separación durante muchos años. Las separaciones analíticas mediante SFC, aunque son difíciles de realizar correctamente, son muy convenientes para el cribado quiral rápido, el desarrollo de métodos quirales, la determinación del exceso enantiomérico y los estudios de inversión quiral. A diferencia de la LC de fase normal, la CC es muy compatible con la detección por espectrometría de masas, lo que permite identificar y caracterizar los enantiómeros y su formación durante las reacciones y los procesos de fabricación, así como en sistemas biológicos (figura 45).

La figura 46 compara la cromatografía de convergencia y la de fase normal para la separación de los enantiómeros de warfarina. La línea base de la CC analiza los enantiómeros en mucho menos tiempo que la fase normal (es hasta 30 veces más rápida). Además, la eliminación de los eluyentes tóxicos, que son costosos tanto de adquirir como de desechar, reduce el coste de las separaciones quirales hasta 100 veces por análisis. Todas estas ventajas hacen de la CC la técnica preferida para los análisis quirales de cualquier tipo.

Isómeros posicionales y análogos estructurales

La CC es útil para separar isómeros posicionales y otros análogos estructurales. Los isómeros posicionales son compuestos con el mismo peso molecular (isobáricos), pero difieren en la ubicación de sus grupos funcionales. Se suelen emplear en aplicaciones que implican el análisis de materias primas, el control de reacciones y la catálisis asimétrica. A menudo, estos compuestos se derivatizan antes del análisis mediante GC para que ayuden en la separación de los isómeros. Los métodos de LC de fase normal son intrínsecamente menos robustos y más lentos. Por otro lado, la selectividad de las separaciones mediante CC separa fácilmente los isómeros posicionales sin derivatizarlos bajo un conjunto genérico de condiciones.

El sistema ACQUITY UPC² (figura 47) separa los isómeros con tanta rapidez que puede ayudar a evaluar en tiempo real la optimización de la reacción de las materias primas, los materiales intermedios y los productos finales. Los análogos estructurales son difíciles de separar debido a su similitud y pueden ser biomarcadores conjugados o no conjugados (ejemplos: glucurónidos, sulfatos), así como metabolitos, productos de degradación e impurezas de compuestos farmacológicos. Los esteroides son una de las clases más populares de análogos estructurales (figura 48). La similitud estructural entre diferentes esteroides hace que sean difíciles de separar y analizar incluso si se utiliza la detección de MS, porque las diferencias de masa son mínimas. Analizarlos es sencillo mediante CC, que utiliza un cribado genérico por gradiente en varias columnas en menos de dos minutos (figura 49). Esta separación es un desafío para la LC de fase reversa por la naturaleza apolar de los compuestos, y la GC requiere derivatización para mejorar la forma de pico y los límites de detección. La combinación del sistema ACQUITY UPC² con la detección de MS es un buen método para identificar y cuantificar los esteroides.

Los análogos estructurales conjugados son más difíciles de separar. Los esteroides libres (figura 48) son insolubles en agua, por lo que el cuerpo los convierte en derivados hidrosolubles, transformándolos en su forma sulfatada. Este proceso produce un grupo lateral hidrofílico cargado negativamente, lo que los hace hidrosolubles (figura 50). Estos compuestos se aíslan de partir de productos naturales para su uso terapéutico y se utilizan como biomarcadores para estudiar enfermedades y determinar la eficacia de un tratamiento. El análisis de estos compuestos presenta dos grandes dificultades.

Por un lado, se necesitan 2,5 horas para preparar una muestra para un análisis mediante GC de 30 minutos, que requiere una hidrólisis enzimática del grupo de sulfato y, más tarde, una derivatización. En segundo lugar, la espectrometría de masas no puede distinguir algunos de estos estrógenos, ya que son isobáricos (relación m/z idéntica). Por tanto, se necesita la cromatografía para separar diferentes formas de los compuestos isobáricos.

Mediante CC, los 10 estrógenos sulfatados se pueden separar en 15 minutos (figura 51), incluidos dos picos que eluyen casi al mismo tiempo (picos 6 y 7) que no se pueden separar fácilmente mediante un análisis de GC de 30 minutos (figura 52). Gracias a la CC, la muestra no tiene que hidrolizarse ni derivatizarse porque los compuestos sulfatados se pueden analizar en su forma original. Esto reduce significativamente la cantidad de pasos necesarios para analizar las formulaciones terapéuticas, lo que mejora el rendimiento y la productividad.

La Tabla 8 resume las ventajas de usar la CC para las aplicaciones discutidas anteriormente y resalta otras áreas de aplicación para separar enantiómeros, isómeros posicionales y análogos estructurales.

Ortogonalidad

Los modos ortogonales de separación son complementarios entre sí, pero únicos en la forma en que retienen los picos y, al hacerlo, generan más información sobre una muestra que un solo modo de separación. La capacidad de analizar analitos utilizando diferentes técnicas es importantísima por las siguientes razones:

• La seguridad de que se pueda identificar y caracterizar una impureza, un pico de degradación o un compuesto similar, como los compuestos isobáricos o los que coeluyen.
• La garantía de la caracterización completa de una muestra.
• La capacidad para obtener más información sobre una muestra.
• La separación de los compuestos deseados de las interferencias de la matriz.

Entre los ejemplos de técnicas de separación ortogonal encontramos modos complementarios como la cromatografía de fase normal y la de fase reversa. La selectividad de la CC es similar a la de la cromatografía de fase normal, pero es mucho más robusta, fiable (consultar el capítulo 2) y reproducible que cualquier método de fase normal. La siguiente sección muestra ejemplos de cómo se utiliza la CC como un modo de separación ortogonal para lograr los objetivos anteriormente enumerados.

La separación de un principio activo farmacéutico (metoclopramida) de sus sustancias relacionadas mediante los sistemas ACQUITY UPLC y ACQUITY UPC² demuestra esta ortogonalidad (figura 53). Los picos que no se analizan con una técnica se analizan con la otra, y viceversa. La CC es capaz de retener compuestos polares durante más tiempo que la RPLC, como se ve en los picos 1 y 2. En este ejemplo, el sistema ACQUITY UPC² analiza los pares críticos (pico 5 y metoclopramida), lo que facilita la purificación y el aislamiento a mayor escala de compuestos desconocidos para su posterior identificación y caracterización. Todo esto hace que la CC sea una técnica ideal para usar en paralelo con otras técnicas habituales para ayudar a resolver una gran diversidad de retos en las separaciones.

Los métodos ortogonales también son importantes para separar los analitos de interés de las interferencias de la matriz, por ejemplo, en el bioanálisis o el análisis de alimentos.

La figura 54A muestra un ejemplo típico de un cromatograma LC-MS/MS de clopidogrel extraído de plasma humano utilizando precipitación de proteínas. Dada la hidrofobicidad del clopidogrel, eluye hacia el final del análisis. Los fosfolípidos que interfieren (con un grupo de cabeza que contiene colina) también eluyen en esta misma región (figura 54B), lo que puede causar la supresión de iones del pico de clopidogrel y una cuantificación variable. Curiosamente, los fosfolípidos interferentes eluyen aproximadamente en la misma región del sistema ACQUITY UPC² (figura 54C). Debido a la ortogonalidad de la CC con respecto a la LC de fase reversa, el analito de interés eluye mucho antes y se aleja de estos fosfolípidos interferentes (figura 54D). Esto minimiza la posibilidad de sufrir efectos de matriz, lo que garantiza una cuantificación más exacta y precisa.

Como se menciona al comienzo de este capítulo, todos estos beneficios ilustran las tres propiedades clave de la CC:

1. Simplifica el flujo de trabajo.
2. Separa compuestos con similitud estructural.
3. Es ortogonal a la LC de fase reversa.

• Combina varias técnicas en una.
• Reduce los tiempos de preparación y análisis de muestras.
• Se puede emplear para la inyección directa de extractos/eluyentes orgánicos.

• Enantiómeros (quirales).
• Isómeros posicionales.
• Análogos y conjugados estructurales.

• Mayor fiabilidad al identificar de impurezas/productos de degradación.
• Caracterización completa de la muestra.
• Separación de analitos de las interferencias de la matriz.