Änderungen der Peakform bei einer zuvor verwendeten Säule

Wie in dieser Serie besprochen, sind Änderungen der Peakform ein häufiges Problem bei HPLC-Analysen. Idealerweise sollten die Peaks symmetrisch sein und eine Gauß-Form aufweisen [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), S. 353–362]. Die Symmetrie eines Peaks kann durch Berechnen des USP-Tailingfaktors (T) quantifiziert werden, wie in Abbildung 1 dargestellt. Ein Tailingfaktor von 1 weist auf ideale Symmetrie hin, während Werte unter 1 als Fronting und Werte über 1 als Tailing bezeichnet werden. Bei vielen Methoden ist es erforderlich, dass die Tailingfaktoren für alle Peaks innerhalb eines bestimmten Bereichs liegen. Tailingfaktoren, die erheblich von 1 abweichen, können die Auflösung von Peaks, die nah beieinander eluieren, verringern, was die Integration erschwert [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), S. 353–362].

Beim Einrichten des Systems mit dem Ziel, eine etablierte Methode an einer bereits verwendeten Säule auszuführen, sollte ein Systemeignungstest durchgeführt werden, um zu prüfen, ob die Säule in gutem Zustand ist. Mit diesem Test wird die Fähigkeit der Säule und des Systems beurteilt, einen akzeptablen Druck, Retentionszeiten, Peakflächen, Peakbreiten und Peaksymmetrie zu erzeugen. Eine signifikante Änderung dieser Signale im Vergleich zu den zuvor mit der Säule erhaltenen Ergebnissen könnte auf ein Problem mit dieser hinweisen. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel, bei dem Umkehrphasen-Referenzmaterial zur QK von Waters (Teilenummer 186006363) verwendet wurde. Dieses Referenzmaterial, das sieben Verbindungen enthält, wurde mithilfe einer Gradientenmethode analysiert. Anfänglich (Abbildung 2A) lagen die USP-Tailingfaktoren zwischen 0,90 und 1,27 und damit in einem akzeptablen Bereich. Nachdem die Säule aus dem System entfernt und später wieder angeschlossen wurde, wurde dieselbe Testmethode durchgeführt, wodurch das in Abbildung 2B dargestellte Chromatogramm erstellt wurde. Die Retentionszeiten, Peakfläche und der Säulendruck waren zwar ähnlich wie bei den ursprünglichen Ergebnissen, die USP-Tailingfaktoren für alle sieben Peaks waren jedoch höher und reichten von 1,32 bis 1,65.

Wie in Teil 1 besprochen, gibt es mehrere mögliche Ursachen für Änderungen der Peaksymmetrie, einschließlich Problemen mit dem HPLC-System, der mobilen Phase, der Probe und der Säule [J. W. Dolan und L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, S. 385–420]. Wie bereits besprochen, ist ein guter Ausgangspunkt für die Fehlersuche die sorgfältige Analyse der Chromatogramme. Dadurch kann erkannt werden, ob die Änderung der Peakform bei allen Peaks zu beobachten ist oder nur bei einigen. Wenn alle Peaks in einem Chromatogramm ähnliche Änderungen der Peakform aufweisen, wie in Abbildung 2B dargestellt, können mögliche Ursachen ein Leerraum in der Säule, eine Ansammlung von Bestandteilen der Probenmatrix in der Säule oder eine fehlerhafte Verbindung der Säule mit dem HPLC-System sein. Da das Problem bei der früheren Verwendung der Säule nicht aufgetreten ist, ist es unwahrscheinlich, dass die Säule einen Leerraum oder eine Ansammlung der Probenmatrix aufwies. Daher ist die wahrscheinlichste Ursache eine schlechte Verbindung zum HPLC-System. Die Säulenanschlüsse wurden wiederhergestellt und der Systemeignungstest wurde erneut durchgeführt. Wie in Abbildung 2C gezeigt, wurden die USP-Tailingfaktoren auf die ursprünglichen Werte zurückgesetzt. Dies bestätigt, dass das Problem durch einen fehlerhaften Anschluss der Säule verursacht wurde, der eine Lücke zwischen der Säule und der Kapillare verursachte, die sie mit dem System verbindet (siehe Abbildung 3). Schon eine kleine Lücke reicht aus, um eine Verzerrung der Peakform zu verursachen. Veranschaulichungen dazu, wie Säulen mit verschiedenen Endfittingtypen an mehrere HPLC-Systeme angeschlossen werden, finden Sie in den Videos unter dieser URL: How to Connect HPLC Columns to Waters LC Systems (Verbinden von HPLC-Säulen mit LC-Systemen von Waters)