• 应用纪要

在法医毒理学研究中使用UPLC-MS/MS分析毛发中的羧基-THC

在法医毒理学研究中使用UPLC-MS/MS分析毛发中的羧基-THC
  • Jane Cooper
  • Michelle Wood
  • Waters Corporation
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仅适用于法医毒理学应用。

摘要

本应用简报介绍了一种分析毛发中11-去甲-9-羧基-Δ9-四氢大麻酚（羧基-THC）的稳健UPLC-MS/MS方法，该方法能达到国际毛发检测协会(SoHT)建议的确认截止浓度1,2。

优势

  • 所用基质可延长药物检测窗口，并以非侵入性方式收集
  • 用于净化萃取物的SPE方案简单有效
  • 一种使用UPLC-MS/MS灵敏测定毛发中羧基-THC的稳健方法 

简介

过去十年来，在法医检测中，将毛发作为生物基质的应用越来越广泛。药物进入毛发的机制有很多种，包括：

  • 在毛囊处的供血过程中被动扩散到正在生长的毛发基质中
  • 从汗液或皮脂扩散到毛干中
  • 外部污染（如烟雾或被污染的手）

使用毛发作为样本有诸多优势。相较于血液等其他基质，毛发采集起来更简单，不需要由经过医学培训的人员来执行。这种样品采集方式不会被视为侵入性采集，这意味着采集过程可以在监督下完成，可降低样品掺假的可能性。此外，毛发采集完成后，可方便地在室温下运输和储存，以待分析。

然而，毛发的主要优势在于可以延长药物的检测窗口。某些传统基质（例如血液和尿液）中的药物只能在用药后数小时/数天以内检出，而与之相比，毛发中的药物在用药后数月甚至数年内都可以检出。已知毛发以每月约1 cm的速率生长，因此根据SoHT的建议，从头的后顶部采集的典型毛发样品足以作为累积样本，帮助我们深入了解采样对象近几个月来的药物使用情况。

大麻是世界上使用最广泛的药物物质，因此大麻素是检出率最高的一类药物，这类药物的分析在法医药物检测中至关重要。尽管Δ-9-四氢大麻酚(THC)是大麻中的主要精神活性成分，并且可以在吸食者的毛发中检出，但毛发的THC鉴定结果呈阳性也可能归因于被动烟雾暴露，仅凭这一个结果并不能明确证明受测对象吸食了大麻。因此，SoHT建议通过测定羧基-THC这种代谢物来确认毛发的THC阳性鉴定结果。然而，分析羧基-THC的难度相当大，其浓度通常低至pg/mg水平，而且可获取的样品往往有限，因此必须采用高灵敏度的分析技术。

实验

毛发样品由志愿者提供，以单样或混合样品的形式进行分析。M3试剂由Comedical（意大利特伦托，http://www.comedical.biz/）提供。羧基-THC和氘代类似物羧基-THC-D3认证参比物质购自Merck（英国多塞特）。

毛发样品依次用二氯甲烷、甲醇和二乙醚净化后，剪成1~2 mm的小段。称取25 mg毛发样品放入带有密封盖的玻璃离心管中，基质校准品中加标浓度在0.2~10 pg/mg范围内的羧基-THC。加入氘代内标（羧基-THC-D3）和0.5 mL M3试剂。将样品置于100 ℃下温育60 min，冷却后将全部样品上样至OASIS™ PRiME HLB 30 mg小柱（P/N：186008055）。依次使用乙腈/水(1:1 v/v)和己烷清洗样品。用乙腈/甲醇(9:1 v/v)洗脱羧基-THC，挥干溶剂后，使用100 μL含0.25%氨水的50%甲醇溶液（5 mL甲醇，4.9 mL去离子水，100 μL 25%氨水溶液）复溶样品，涡旋混合，然后转移到Waters™全回收样品瓶（P/N：186000385c）中。测定毛发中羧基-THC的工作流程如图1所示。

图1.测定毛发中羧基-THC的工作流程

在配备VanGuard™ FIT, 1.7 µm, 2.1 x 150 mm保护柱的ACQUITY™ Premier BEH™ C18色谱柱上使用氟化铵(pH 9.5)和甲醇梯度对羧基-THC进行色谱分离。使用Xevo™ TQ Absolute质谱仪监测羧基-THC的两个MRM通道，即m/z 343.1 > 191.0（定量离子）和m/z 343.23 > 245.1（定性离子）。使用通道m/z 346.1 > 248.1监测内标（羧基-THC-D3）。

结果与讨论

加标1 pg/mg羧基-THC的毛发样品的定量离子、定性离子和内标的MRM通道色谱图如图2A所示。   

图2B是经过平滑处理和积分的定量离子MRM色谱图，比较了分别使用混合毛发样品（来自多名志愿者）和金色毛发样品（来自同一名志愿者）制备的对照（空白）毛发萃取物与加标SoHT推荐的羧基-THC截止浓度(0.2 pg/mg)的毛发样品。

图2.A) 1.0 pg/mg加标混合毛发样品的定量离子（上图）、定性离子（中图）和内标（下图）的积分MRM色谱图。B)MRM色谱图，显示了分别使用混合毛发样品和金色毛发样品制成的对照(0 pg/mg)毛发样品（上方迹线）以及羧基-THC加标(0.2 pg/mg)毛发样品（下方迹线）的定量离子MRM通道。

图3显示了使用混合毛发样品和金色毛发样品制备的0.2 pg/mg羧基-THC加标毛发样品的定量MRM通道信噪比（峰到峰；PtP）计算值。

图3.未经平滑处理的原始色谱图，显示了0.2 pg/mg加标毛发样品（金色毛发和混合毛发）定量离子（上方迹线）和定性离子（下方迹线）的MRM通道的信噪比计算值。

分3个单独的批次研究分析方法在0.2~10 pg/mg范围内的线性。所有批次的决定系数(R2)均大于0.99，所有测定浓度相比预期值的偏差都在15%以内，但浓度最低的校准品除外（偏差在20%以内）。

我们对混合毛发样品进行了5次萃取分析，考察了该方法的稳健性。毛发样品分析的平均精密度为1.8% RSD（相对标准差%），不同毛发样品间观察到的总精密度为8.4% RSD，如图4所示。

图4.加标混合毛发样品中羧基-THC分析的稳健性数据

为了评估是否存在前一个样品转移/污染造成的潜在残留，我们先进样5 pg/mg的加标毛发校准品，然后进样了空白样（进样溶剂）。如图5所示，未检出残留。

图5.先进样5 pg/mg的加标毛发标准品，然后进样空白样（进样溶剂），评估羧基-THC残留。

由于毛发是一种复杂基质，我们在样品前处理过程中加入了同位素标记的内标(羧基-THC-D3)，以补偿回收率和基质效应。基质效应可通过基质因子(MF)来衡量，方法是比较羧基-THC溶剂标准品(0.05 ng/mL)与等效基质标准品(0.2 pg/mg, n=5)的峰面积响应，不使用内标时，MF=64%；使用内标时，MF=100%。这些结果表明，该方法表现出36%的离子抑制，但这种抑制通过添加内标得到了很好的补偿。

结论

法医毒理学检测需要快速、准确、可靠且稳健的方法来定量各种生物基质中的化合物，这对于可靠地检测和报告结果至关重要。以毛发作为生物基质，可以在监督之下通过较为简单的非侵入性方式采集样品，用于检测此类方案通常要检测的相关化合物。 

本研究证明，ACQUITY UPLC I-Class PLUS/Xevo TQ-Absolute系统检测毛发中的羧基-THC可达到亚pg/mg水平(0.2 pg/mg)的灵敏度，达到SoHT推荐的截止浓度。

参考资料

  1. G.A.A. Cooper, R. Kronstrand, P. Kintz.Society of Hair Testing Guidelines for Drug Testing in Hair.Forensic Science International 281 (2012) 20–24.
  2. Statements of the Society of Hair Testing Concerning the Examination of Drugs in Human Hair [cited 14th Aug 2023].Available from: https://www.soht.org/statements

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