各种长度和修饰的反义寡核苷酸的高灵敏度生物分析

本应用简报展示了Xevo™ TQ Absolute三重四极杆质谱仪对人血浆基质中不同长度（18~33个核苷酸）、连接子和修饰的寡核苷酸进行生物分析的灵敏度和适用性。

优势

结合ACQUITY™ Premier UPLC系统和ACQUITY Premier C₁₈寡核苷酸分析专用柱，Xevo TQ Absolute质谱仪对寡核苷酸展示出更高的色谱回收率以及优异的（亚ng/mL级）系统灵敏度，有助于完成具有挑战性的LC-MS/MS分析和PK研究。

之前的研究使用GEM91/Trecovirsen证明了高灵敏度和五个数量级的动态范围性能¹。本研究将这种方法扩展运用于不同长度和修饰的反义寡核苷酸(ASO)。

向血浆样品中加入浓度为0.1 ng/mL~1000 ng/mL的多种ASO，包括2'-MOE修饰的碱基、GalNAc偶联物或硫代磷酸酯连接子（Eluforsen、Fomivirsen、Mipomersen、Nusinersen和GalNAc偶联寡核苷酸）。使用液-液萃取法提取100 µL血浆标准品。使用GEM91 (100 ng/mL)作为内标来定量所有寡核苷酸。100 mM六氟异丙醇(HFIP) + 15mM N, N-二异丙基乙胺(DIPEA)的水溶液和90%乙腈溶液分别用作流动相A和流动相B。

完整的方法详情请参阅Waters™应用纪要720007574ZH。

为了证明重现性，将两份校准标准品和ASO组（表1）每个QC浓度六份重复样在三天运行三次。校准曲线呈线性，r²值>0.99（1/x²加权），且>75%的非零校准品水平和QC样品在每次运行中都符合可接受标准，即，非零校准品和QC样品应为±15%，LLOQ水平除外，其中每次运行的校准品或QC样品应为标示浓度的±20%，如表2和3所示。

方法开发使用了优化后的离子通道，这些离子通道在多种母离子电荷态和产生的碎片离子质量数中进行了评估。负离子模式检测能力增强能够改善分析的离子计数、S/N和检测限。在人血浆中0.1~1000 ng/mL的校准范围内实现了0.1 ng/mL（GalNAc寡核苷酸为0.2 ng/mL）的定量下限(LLOQ)，如图1所示，该图显示了所有寡核苷酸最低浓度校准标准品的代表性色谱图。

• 对于不同长度(18~33 nt)以及具有各种连接子和修饰的反义寡核苷酸，在人血浆中观察到亚ng/ml水平的灵敏度和良好的动态范围性能。
• MaxPeak™ HPS技术减少了非特异性结合、金属吸收，并实现了出色的灵敏度和低浓度检测。
• Xevo TQ Absolute串联质谱仪对棘手的负电离化合物具有非常高的灵敏度，能够为基于LC-MS/MS定量生物基质中反义寡核苷酸的常规应用生成高质量数据。

致谢

本文作者由衷感谢Greg Jones和Alnylam Pharmaceuticals为我们的实验无偿提供21 mer GalNac寡核苷酸。
这与Mary Trudeau的应用纪要720007418ZH相同。

1. Suma Veeramachineni, Mark D Wrona, 反义寡核苷酸的高灵敏度LC-MS/MS生物分析定量, 沃特世, 应用纪要, 720007574ZH, 2022年3月.